NEB NGS二代测序RNA建库试剂
——RNA建库试剂盒、rRNA去除试剂盒

 
北京泽平代理美国进口NEB（New England Biolabs）公司NGS二代测序RNA建库试剂盒，应用于Illumina、MGI华大智造测序仪及其他二代测序平台，提供NEBNext系列RNA文库构建试剂盒、接头引物等，包括NEBNext Ultra II RNA 定向建库试剂盒（特异性建库试剂盒）、单细胞建库试剂盒（2pg超低起始量建库）、sRNA建库试剂盒（Small RNA 建库）、核糖体RNA去除试剂盒（rRNA去除试剂盒，mRNA富集）等，支持不同样本（包括FFPE RNA、血液RNA）进行全转录组建库/total RNA 建库、mRNA建库、lncRNA建库、miRNA建库等。NEB试剂性能稳定，实验结果具备高重现性。NEBNext自2009年上市以来，被≥15,000篇文献引用。



NEBNext测序试剂盒（Kit）包括了整个文库制备流程所需的全部试剂，许多试剂盒提供纯化和片段筛选用磁珠；NEBNext模块（Module）仅包含文库制备其中一个步骤所需试剂，一系列NEBNext模块可组合用于完整的文库制备流程，满足特殊实验需求，接头和引物模块大部分单独提供，应用更灵活。



 
一、全转录组测序RNA建库试剂盒（Illumina）

1、NEBNext Ultra II RNA 链特异性文库制备试剂盒（NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina，货号E7760）作为RNA定向建库试剂盒（RNA链特异性建库试剂盒），能显著提高RNA测序实验的灵敏度和特异性，并以更低的起始量获得更多的RNA。该试剂盒对每个步骤都进行了配方优化，使文库产量得到成倍的增长、起始样本量要求更低、PCR循环数更少，若与核糖体RNA（rRNA）去除试剂盒或poly(A)富集试剂盒结合使用，可从10ng~1µg的总RNA中制备高质量的文库。Ultra II RNA链特异性建库试剂盒采用“dUTP方法”实现定向文库制备（链特异性文库制备），并具有精简、可自动化的实验流程，为反义转录本鉴定、非编码RNA转录链判定、编码或非编码重叠转录本表达水平衡量提供帮助，显著提高RNA-seq实验价值。该试剂盒不包含接头、引物、rRNA去除试剂、poly(A) mRNA 分离试剂，须单独购买。

·文库产量非常高，满足更多实验需求；
·起始量范围广，10ng~1µg总RNA（polyA mRNA 实验流程或rRNA去除实验流程），均可制备高质量文库；
·提高文库复杂度和转录本覆盖度；
·减少PCR循环数获得更低的偏嗜性；
·即使是低质量的RNA（如FFPE RNA），也有稳定可靠的表现；
·节省时间，精简实验流程，减少手动操作时间，与自动化兼容。

此外，NEB还提供包含SPRIselect纯化磁珠的NEBNext Ultra II RNA 链特异性文库制备试剂盒-含纯化磁珠（货号E7765），用于片段筛选和纯化，提高实验的灵活性和可靠性。

 
2、NEBNext Ultra II RNA 非链特异性文库制备试剂盒（NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina，货号E7770）作为RNA非定向建库试剂盒（非链特异性建库试剂盒），可显著提高RNA测序实验的灵敏度和特异性，并可降低RNA的起始用量。若与核糖体RNA（rRNA）去除试剂盒或poly(A) mRNA 富集试剂盒相结合，可从10ng~1µg的总RNA中制备高质量的文库。

·文库产量非常高，满足更多实验需求；
·即便起始RNA量很低，10ng~1µg总RNA（polyA mRNA 实验流程或rRNA去除实验流程），也可制备高质量文库；
·提高文库复杂度和转录本覆盖度；
·减少PCR循环获得更低的偏嗜性；
·节省时间，精简实验流程、减少手动操作时间，与自动化兼容。

同时，NEB提供含有SPRIselect磁珠的NEBNext Ultra II RNA 非链特异性文库制备试剂盒-含纯化磁珠（货号E7775），使片段筛选和纯化更具灵活性和可靠性。




3、NEBNext UltraExpress 超快速RNA文库制备试剂盒（NEBNext UltraExpress RNA Library Prep Kit，货号E3330）具有更快、更精简的实验流程，能以各种样本类型的总RNA为起始样本，3h完成RNA文库制备。即使与mRNA富集试剂盒或rRNA去除试剂盒结合使用，仍可在1天内制备出高质量的RNA文库。该试剂盒对所有RNA起始量（25ng~250ng总RNA）采用相同实验流程，包含预混试剂，减少反应时间和纯化步骤。

·更快速，文库制备流程仅需3h，即使与mRNA富集试剂盒或rRNA去除试剂盒结合使用，仍可以在1天内制备出高质量的RNA文库；
·更少的纯化和移液步骤，减少手动操作时间；
·更简便易用，同一个操作流程，适用于所有起始量；
·起始量范围广，25ng~250ng起始量总RNA均可制备高质量文库；
·兼容自动化工作流程，轻松实现扩展。
 

图. NEBNext UltraExpress 超快速RNA文库制备试剂盒实验流程。


图. 使用NEBNext UltraExpress 超快速RNA文库制备试剂盒可实现文库与起始样本之间的转录本表达高度相关性。
A. 使用NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块，从通用人类参考RNA（UHRR）（Agilent）中分离出含有Poly(A)的mRNA。使用NEBNext UltraExpress 超快速RNA文库制备试剂盒制备文库，针对不同起始量样本均使用同样的接头稀释浓度（50×）和12个PCR循环，或使用定制的接头稀释浓度和PCR循环（250ng使用20×接头稀释浓度和10个PCR循环，75ng 使用100×接头稀释浓度和12个PCR循环，25ng使用100×接头稀释浓度和14个PCR 循环）。
B. 使用NEBNext rRNA 去除试剂盒v2-人/小鼠/大鼠从UHRR中去除核糖体RNA（rRNA）。使用NEBNext UltraExpress 超快速RNA文库制备试剂盒制备文库时，针对不同起始量样本均使用同样的接头稀释浓度（50×）和11个PCR循环，或使用定制的接头稀释浓度和PCR循环（250ng使用20×接头稀释浓度和9个PCR循环，75ng使用100×接头稀释浓度和11个PCR循环，25ng使用100×接头稀释浓度和13个PCR循环）。
所有文库均使用Illumina NextSeq 500（2×75 bases）测序。每个文库采样1000万个双端Reads，使用Salmon v1.5.1 量化所有GENCODE v38 转录本和ERCCs，并比较文库与起始样本之间的转录本表达相关性。每个点代表一个转录本，y轴代表起始量250ng总RNA的Reads数（log10），x轴代表起始量250ng、75ng和25ng的重复样本。


图. 针对不同类型的起始样本，使用NEBNext UltraExpress 超快速RNA文库制备试剂盒可实现转录本表达高度相关性。
（A）使用NEBNext Globin mRNA & rRNA 去除试剂盒-人/小鼠/大鼠去除人全血（HWB）样本中RNA的珠蛋白mRNA和rRNA，（B）使用NEBNext rRNA 去除试剂盒-细菌从20种不同细菌混合样本（ATCC货号MSA-2002）中去除rRNA。使用NEBNext UltraExpress 超快速RNA文库制备试剂盒制备文库时，针对每个起始量样本使用定制的接头稀释浓度和PCR循环（250ng使用20×接头稀释浓度和9个PCR循环，75ng使用100×接头稀释浓度和11个PCR循环，25ng使用100×接头稀释浓度和13个PCR循环）。所有文库均使用Illumina NextSeq 500（2×75 bases）测序。每个文库采样1000万个双端Reads，使用Salmon v1.5.1 量化所有GENCODE v38 转录本（HWB）和复合基因组（细菌）。每个点代表一个转录本，y轴代表起始量250ng总RNA的Reads数（log10），x轴代表起始量250ng、75ng和25ng的重复样本。

 

 

 

 
二、单细胞测序RNA建库试剂盒（Illumina）

NEBNext单细胞/超低起始量RNA文库制备试剂盒（NEBNext Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit for Illumina，货号E6420）可从单个细胞或超低起始量的RNA构建全长转录本的高质量文库，可单管完成从细胞裂解到cDNA的全部实验流程，不同GC含量的样本可使用同一种酶混液同时完成DNA片段化、末端修复和加dA尾三个步骤。优化的实验流程满足了更高灵敏度、更快速的文库构建需求。

·从单细胞或低至2pg~200ng的RNA制备高产量的高质量测序文库；
·可用于非常难检测的低丰度转录本；
·不同起始量及样本类型，均能保证转录本检测的一致性；
·不同起始量及样本类型，均能获得全长转录本和均一的覆盖度；
·适用于体外培养细胞、原代细胞、总RNA；
·节省时间，快速精简的实验流程，非常少的操作步骤，减少手动操作时间。


图. NEBNext单细胞/超低起始量RNA文库制备工作流程。

 

 

 

 
三、Small RNA 建库试剂盒/小RNA建库试剂盒（Illumina）

1、NEBNext Small RNA 多样本文库制备试剂盒1（12种Index引物，NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (Set 1)，货号E7300）包含接头和具有12种Index的多样本引物，可实现多样本建库，在保证制备高产量和多样性文库的同时，更大限度减少接头二聚体的形成。

·更大限度地减少接头二聚体污染；
·高产量；
·总RNA可作为起始样本；
·适用于甲基化的Small RNA（如piRNA）以及未甲基化的Small RNA。


图. 适用于Illumina测序平台的Small RNA 文库制备流程。

同时，NEBNext Small RNA 多样本文库制备试剂盒2（12种Index引物，NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (Set 2)，货号E7580）、NEBNext Small RNA 多样本文库制备试剂盒（48种Index引物，NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48)，货号E7560），提供了不同于E7300的Index引物，用于多样本建库。



 

 

 

 
四、通用型RNA建库试剂盒（Illumina+MGI）

NEBNext RNA 文库制备试剂盒（货号E9625）可用于Illumina和MGI测序仪，试剂盒包含经优化的组分和操作流程，样本起始量范围广，使用10ng~1µg的总RNA样本，均可制备高质量链特异性RNA文库（RNA定向建库）。该试剂盒可与rRNA去除或poly(A)富集流程结合使用。

·文库产量高，满足更多实验需求；
·样本起始量范围广，10ng~1µg总RNA均可制备高质量文库；
·提高文库复杂度和转录本覆盖度；
·均一的转录本覆盖度和GC覆盖度；
·更大限度地减少接头二聚体；
·稳定可靠的结果表现；
·节省时间，精简实验流程，减少手动操作时间，与自动化兼容。


图. NEBNext RNA 文库制备试剂盒实验流程。


图. 针对不同起始量样本，NEBNext RNA 文库制备试剂盒均能制备高产量文库。
A. 使用NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块，从人类通用参考RNA（UHRR）（Agilent）中分离出含有Poly(A)的mRNA。使用NEBNext RNA 文库制备试剂盒并根据建议的接头稀释浓度和PCR循环数制备文库。
B. 从UHRR中去除核糖体RNA（rRNA）（NEBNext rRNA 去除试剂盒v2-人/小鼠/大鼠），使用NEBNext RNA 文库制备试剂盒并根据建议的接头稀释浓度和PCR循环数制备文库。图中显示了三次重复建库的平均产量，误差条表示标准偏差。


图. NEBNext RNA 文库制备试剂盒能够实现均一的转录本覆盖度。
A. 使用NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块，从人类通用参考RNA（UHRR）（Agilent）中分离出含有Poly(A)的mRNA。使用NEBNext RNA 文库制备试剂盒根据建议的接头稀释浓度和PCR循环数制备文库。
B. 从UHRR中去除核糖体RNA（rRNA）（NEBNext rRNA 去除试剂盒v2-人/小鼠/大鼠），使用NEBNext RNA 文库制备试剂盒根据建议的接头稀释浓度和PCR循环数制备文库。所有文库均使用MGI DNBSEQ-G400（2×100 bases）测序。从每个文库抽取1000万个reads，并使用RNA STAR v2.7.8a 比对至hg38参考基因组，使用CollectRnaSeqMetrics（Picard）tool v2.18.2.2 计算1000个高丰度转录本的5'→3'转录本覆盖度。从不同起始量制备的文库均能实现均一的转录本覆盖度。


图. NEBNext RNA 文库制备试剂盒可针对高丰度和低丰度转录本进行高水平检测。
A. 使用NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块，从人类通用参考RNA（UHRR）（Agilent）中分离出含有Poly(A)的mRNA。使用NEBNext RNA 文库制备试剂盒根据建议的接头稀释浓度和PCR循环数制备文库。
B. 从UHRR中去除核糖体RNA（rRNA）（NEBNext rRNA 去除试剂盒v2-人/小鼠/大鼠），使用NEBNext RNA 文库制备试剂盒根据建议的接头稀释浓度和PCR循环数制备文库。所有文库均使用MGI DNBSEQ-G400（2×100 bases）测序。从每个文库抽取1000万个reads，分别对检测到的≤10个reads和≤500个reads的转录本的平均转录本丰度进行评估。误差条表示三次重复的标准偏差。使用Salmon v1.5.1 对所有GENCODE v38 转录本和ERCCs进行比对和量化。两个实验流程所有起始量样本文库中都观察到了高水平转录本检测。


图. NEBNext RNA 文库制备试剂盒能够在起始样本和重复样本之间实现出色的转录本相关性。
A. 使用NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块，从人类通用参考RNA（UHRR）（Agilent）中分离出含有Poly(A)的mRNA。使用NEBNext RNA 文库制备试剂盒根据建议的接头稀释浓度和PCR循环数制备文库。
B. 从UHRR中去除核糖体RNA（rRNA）（NEBNext rRNA 去除试剂盒v2-人/小鼠/大鼠），使用NEBNext RNA 文库制备试剂盒根据建议的接头稀释浓度和PCR循环数制备文库。所有文库均使用MGI DNBSEQ-G400（2×100 bases）测序。从每个文库抽取1000万个reads，使用Salmon v1.5.1 对所有GENCODE v38 转录本和ERCCs进行了定量，以评估起始样本间转录本表达水平的相关性。每个数据点代表一个转录本，以y轴上的1μg总RNA起始样本的reads Counts 的对数丰度（log10）与x轴上的1μg重复样本、200ng、100ng和10ng的起始样本进行比较。在不同起始样本和重复样本中检测到的转录本数量具有非常高的相关性。

 

 

 

 
五、rRNA去除

NEBNext rRNA 去除试剂盒能去除高丰度的核糖体RNA（rRNA）、血液中的珠蛋白mRNA，同时保留低丰度的目的RNA，其采用“RNase H”方法，将探针与不需要的、高丰度的RNA紧密结合，确保即使是降解的RNA也能被有效去除。根据物种类型，提供相应的rRNA去除试剂盒。

·同时适用于低质量（如FFPE）、高质量的RNA样本；
·起始量范围广，10ng~1μg；
·高效去除高丰度rRNA、珠蛋白mRNA，保留目的RNA；
·超快的实验流程（仅需2h），手动操作时间少于10min;
·去除rRNA后的RNA产物可用于RNA测序、随机引物介导的cDNA合成、或其它下游的RNA分析应用;
·可提供用于RNA纯化的Agencourt RNAClean XP 磁珠。


图. NEBNext rRNA 去除试剂盒流程。单链DNA探针特异性的和总RNA（0.1μg~1μg）中的细胞质rRNA（包括5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA 和28S rRNA）和线粒体rRNA（12S rRNA和16S rRNA）杂交，之后RNase H 酶降解杂交的RNA。用DNase l 降解DNA探针。使用Agencourt RNAClean XP 磁珠纯化去除rRNA后的RNA。去除rRNA后可立即用于RNA测序文库制备。


图. NEBNext rRNA 去除试剂盒流程时间。

 
1、NEBNext rRNA 去除试剂盒v2-人/小鼠/大鼠（NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat)，货号E7400）。

·高效去除人、小鼠、大鼠RNA中的rRNA；
·可去除细胞质rRNA（包括5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA、人ITS、人ETS）和线粒体rRNA（12S rRNA 和 16S rRNA）；
·起始量范围广，10ng~1µg；
·同时适用于低质量和高质量RNA样本；
·超快的实验流程（仅需2h），手动操作时间少于10min。

NEB还提供包含纯化磁珠的NEBNext rRNA 去除试剂盒v2-人/小鼠/大鼠-含RNA纯化磁珠（NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat) with RNA Sample Purification Beads，货号E7405）。


图. 高效去除完整和降解RNA（FFPE）样本中的rRNA，同时保留编码和非编码转录本。以人通用参考总RNA（UHR，Agilent）和乳腺癌FFPE RNA（样本保存年限分别为1年和10年）为起始样本制备RNA测序文库。起始RNA未经处理或用NEBNext poly(A) mRNA 磁性分离模块或NEBNext rRNA 去除试剂盒处理。使用NEBNext RNA 定向文库制备试剂盒制备RNA测序文库。将Reads与hg19参考基因组进行比对，并采用Picard RNA-seq Metrics 评估Reads分布水平。相较于poly(A) mRNA 富集方法，使用rRNA去除后制备的RNA文库残留的rRNA Reads 数更低，同时保留了更多的非编码Reads。即使针对FFPE RNA 样本，也能高效去除rRNA。


图. 与未去除rRNA的样本文库之间的转录表达相关性。使用去除和未去除rRNA的人通用参考RNA（Agilent）和乳腺癌FFPE RNA样本（样本保存年限分别为1年和10年）制备文库，去除rRNA选用NEBNext rRNA去除试剂盒-人/小鼠/大鼠。使用NEBNext RNA 定向文库制备试剂盒分别进行建库。使用TopHat2和Cufflinks分别进行Reads比对和转录本组装、定量。FPKM（每百万个映射读取的转录本的千碱基片段数）相关性分析表明：去除rRNA和未去除rRNA的样本文库之间有很好的转录表达相关性（R>0.93)。结果说明：NEBNext rRNA 去除不会影响转录表达水平。


2、NEBNext Globin & rRNA 去除试剂盒-人/小鼠/大鼠（NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)，货号E7750）可去除人、小鼠和大鼠血液样本中的Globin珠蛋白mRNA、细胞质rRNA、线粒体rRNA，对完整RNA和降解RNA均有作用。

·高效、特异性去除细胞质rRNA（5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA）、线粒体rRNA（12S rRNA 和 16S rRNA）、珠蛋白mRNA（HBA1/2、HBB、HBD、HBM、HBG1/2、HBE1、HBQ1、HBZ）；
·同时适用于低质量、高质量RNA样本；
·起始量范围广，10ng~1μg；
·可选用与poly(A) mRNA 分离流程结合使用，去除珠蛋白mRNA、rRNA和非编码RNA；
·超快的实验流程（仅需2h），手动操作时间少于10min。


图. 在不同物种间，去除珠蛋白mRNA和核糖体RNA，富集目的RNA。从人、小鼠和大鼠全血总RNA（1μg ）中仅去除rRNA、或使NEBNext Globin & rRNA 去除试剂盒同时去除珠蛋白mRNA和rRNA。使用NEBNext Ultra ll RNA 文库制备试剂盒分别对未去除和去除后的RNA制备文库，并进行Illumina双端测序（2×75 bp )。使用Mirabait ( 6个或更多，25 mers ）鉴定出rRNA和珠蛋白mRNA的Reads数。残留的rRNA和珠蛋白mRNA水平是通过将匹配上的Reads数除以质控过滤后的总Reads数计算得出。

同时，NEB提供包含纯化磁珠的NEBNext Globin & rRNA 去除试剂盒-人/小鼠/大鼠-含RNA纯化磁珠（NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) with RNA Sample Purification Beads，货号E7755）。

 
3、NEBNext rRNA 去除试剂盒-细菌（NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria)，货号E7850）可从革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌中特异性地去除rRNA，对培养的单一菌种、混合菌种（如：宏转录组学）、以及完整的或降解的RNA都同样有作用。

·高效、特异性去除细菌rRNA（5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA）；
·适用于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌；
·对培养的单一菌种、混合菌种（如：宏转录组）都同样有效；
·起始量范围广，10ng~1µg；
·适用于低质量、高质量的RNA；
·超快的实验流程（仅需2h），手动操作时间少于10min。


图. 从不同起始量的模拟菌群中能高效去除核糖体RNA，富集目的RNA，且保证一致的相关性。从20种不同细菌的冻干混合物（ATCC货号MSA-2002）中提取总RNA。使用NEBNext rRNA 去除试剂盒-细菌去除核糖体RNA（rRNA），使用NEBNext Ultra II 定向文库制备试剂盒分别制备未去除rRNA和去除rRNA后的RNA-seq文库，并进行Illumina双端测序（ 2×75 bp )。采用Hisat2将Reads比对到NCBI基因组数据库中的最佳匹配菌株混合的参考基因组，并采用Picard和ht-seq count 评估重复和转录水平。绝大多数菌种中，起始量为100ng和10ng时，都观察到缺失了已知的rRNA序列。

NEB提供含纯化磁珠版本——NEBNext rRNA 去除试剂盒-细菌-含纯化磁珠（NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria) with RNA Sample Purification Beads，货号E7860）。


4、NEBNext RNA 去除主要试剂套装（可任意物种，NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set，货号E7865）支持使用定制的探针序列，实现从任意物种样本中去除rRNA和其他特定RNA。提供NEBNext定制RNA去除在线设计工具，输入目标RNA序列可获取定制探针序列，将合成的探针与NEBNext RNA 去除主要试剂套装结合使用即可。

·起始量范围广，10ng~1µg；
·适用于低质量、高质量的RNA；
·超快的实验流程（仅需2h），手动操作时间少于10min。

另提供包含纯化磁珠的NEBNext RNA 去除主要试剂套装-含RNA纯化磁珠（货号E7870）。

 

 

 

 
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