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【ELISPOT酶联免疫斑点技术】

酶联免疫斑点技术(Enzyme Linked Immunospot Assay,简称ELISPOT)是细胞免疫学研究中更敏感的检测方法,可以在单细胞水平对抗体分泌细胞(ASC)及细胞因子(CK)分泌细胞进行检测,比ELISA和有限稀释法等具有更髙的灵敏性,能从20万-30万细胞中检岀1个分泌该蛋白的细胞。并且该方法能够对抗原刺激后的活细胞进行功能性检测,具有较髙的特异性、直观可信度髙,并且易操作,已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中,在国内外免疫学界获得了广泛的应用。

 

【ELISPOT实验步骤】

淋巴细胞受到抗原刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被ELISPOT板底PVDF膜上(预包被的)的特异性单抗捕获。去除细胞后,被捕获的细胞因子与生物素标记的单抗结合,其后再与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的亲和素结合。加底物显色后,PVDF膜上出现紫色或红褐色的斑点表明细胞产生了细胞因子,通过酶联免疫斑点分析仪(ELISPOT Reader)对斑点的进行自动计数和分析。
德国AID ELISPOT Reader 酶联免疫斑点分析仪 AID中国一级代理商北京泽平
 

【德国AID酶联免疫斑点分析仪】

德国AID公司多年来专注于联免疫斑点分析仪的研发,自上世纪90年代起,AID公司就已经为世界各地科研、临床、制药实验室提供了大量的酶联免疫斑点分析仪(AID ELISPOT Reader),其在各领域文献中的应用随处可见,已经成为全球科研工作者认可的品牌。

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应用AID酶联免疫斑点分析仪对ELISPOT板上各孔斑点图像进行全自动采集、计数及分析,不仅能够自动得岀斑点数量,给出细胞因子分泌活性值,还能够根据预设的判读规则,直接得出阴阳性结果,并将结果输出到JPG、EXCEL、TXT、PPT等中,还可与实验室的LMS系统相连,进行数据的管理和输出,成为值得信赖的ELISPOT分析工具。
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此外,传统ELISPOT也存在局限,缺乏对T细胞产生的多种细胞因子的同时检测。为克服此难题,以荧光标记为基础,发展了荧光免疫斑点分析法(FluoroSpot)。用这种新的荧光免疫斑点分析技术可以在单一细胞水平检测多细胞因子表达的淋巴细胞,如IFN-γ(绿色荧光标记)与IL-2(红色荧光标记)共表达的T细胞。
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德国AID iSpot Reader第一次实现了应用一台酶联免疫斑点分析仪同时进行传统ELISPOT和荧光免疫斑点Fluorospot这两种分析:AID iSpot Reader 对ELISPOT板上每孔的绿色荧光斑点(FITC标记IFN-γ)和红色荧光斑点(Cy3标记IL-2)各采集一副图像,经FluoroAID专利的荧光图像 Overlay技术将两幅图像融合,保证共染色斑点计数的准确性。
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【ELISPOT试剂盒种类】

AID酶联免疫斑点分析仪采用全球著名的ELISPOT试剂生产商瑞典Mabtech的产品, 可用于人类、猴子、小鼠、大鼠细胞等多个物种,以及兽医领域,检测牛、羊、马和猪源样品的T/B细胞免疫反应。可检测的细胞因子除了IFN-γ及白介素系列,还有TNF-α, Perforin, Granzyme B和MIP-1β等。

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1、人:apoE, GM-CSF, Granzyme B, IFN-α(subt.2,8,10,14,17), IFN-α(pan specific), IFN-γ, IL-1β, IL-2,4,5,6,10, IL-12/-23(p40), IL-12(p70),13,17A,21,23,31, MIP-1β, Perforin, TNF- α;

2、猴子:IFN-γ, IL-2, IL-17;

3、小鼠:GM-CSF, IFN-α, IL-4,5,6, IL-12/-23(p40), IL-13, IL-21, MIP-1β, Perforin, TNF-α. IFN-γ, IL-2, IL-17A;

4、其他:Lyme Spot, EBV-Spot, CMV-Spot, Trans Spot试剂盒;

5、更多T细胞/B细胞 ELISPOT及 Fluoro Spot试剂盒请咨询。

 

【为什么选择ELISPOT?】

1、高灵敏度:20万-30万中1个阳性细胞检测率;

2、直观、可信度高:单细胞水平检测,一个阳性细胞一个斑点,斑点数量代表分泌细胞因子的细胞数量多少,斑点大小代表该细胞分泌细胞因子水平的多少;

3、高通量:一块ELISPOT板可作96test,科研工作者每天可检测数百个样品,只需少量细胞如45mL血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应;

4、活细胞功能检测:检测到的细胞因子不是已存在的,而是在检测过程中,被加入的刺激物刺激而分泌出来的;

5、临床实验适用:经过冻存复苏的细胞并不丧失免疫功能,对临床试验非常重要,治疗前和治疗后的样本可以进行平行测试,结果可以重复;如果试验涉及多个临床机构,血样可冻存、运输到核心实验室进行检测。

 

【ELISPOT已成功应用领域】

1、感染性疾病诊断与研究

ELISPOT除了作为一种科研工具,也被用于临床诊断。近期第一个被SFDA批准的基于ELISPOT法的诊断平台(T-Spot.TB)上市。这项用于检测结核感染的测试方法,是通过测量结核特异性抗原刺激后的IFN-γ分泌情况来检测特异性的T细胞免疫反应。它可以代替传统的皮肤测试,同时大大提高了敏感性和特异性,并且不受卡介苗接种影响。ELISPOT还可用于其他感染性疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒、巨细胞病毒、莱姆病等的抗感染免疫研究与诊断。

 

2、疫苗研究

ELISPOT方法是检测和评价疫苗的细胞免疫水平的国际公认的标准工具国际上普遍采用IFN-γ ELISPOT法监测HIV疫苗研究中的免疫应答反应,在国际艾滋病疫苗行动计划中的大量监测新型HIV候选疫苗的试验中采用ELISPOT法对评价T细胞功能。ELISPOT方法是通过测量疫苗诱导较强T细胞反应的能力,来定义疫苗的效果。在疫苗研发和设计时,可应用ELISPOT方法筛选确定抗原的特异性T细胞表位;这些信息还可以被用于评估合适的免疫策略以及免疫途径。
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中国药品生物制品检定所在《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》及《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》等规定中均指出,ELISPOT方法是检测和评价疫苗细胞免疫效价的有效方法。ELISPOT技术作为检测T/B细胞特异性分泌的更敏感方法,对于检测数量较少的抗原特异性的记忆T细胞也尤为重要,已广泛用于预防性疫苗和治疗性疫苗,如艾滋病疫苗、乙肝疫苗、流感疫苗及各种肿瘤疫苗等的研制和评估。

 

3、免疫学基础研究

根据检测的细胞因子的不同,ELISPOT可以用来区分被激活的不同的T细胞亚群。例如Th1细胞主要分泌IFN-γ,IL-2和TNF-α,而其他一些细胞因子如IL-4,IL-5和IL-13一般是由Th2细胞分泌的。在过敏研究中的一个热点就是采用ELISPOT测定Th2型细胞因子,因为Th2反应是过敏的主要反应,但通常都是低频率岀现,需要高度灵敏方法才能被成功检测到。

 

3、过敏研究

在针对特异反应性过敏的免疫治疗中监测T细胞免疫反应;在细胞介导的接触过敏的体外检测诊断的应用中,ELISPOT方法受到越来越多过敏工作者的关注。因为对于像Th2型反应主要细胞因子IL-4这样的一贯很难通过其他方法如 flow cytometry和ELISA检测到的因子来说,应用高灵敏度的ELISPOT方法对于研究过敏原特异性免疫反应显得尤为重要。
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5、自身免疫病研究

ELISPOT的技术也广泛应用于自身免疫疾病的诊断及病因研究,如I型糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮等疾病病因分析、疾病的预测、早期诊断、指导治疗以及预后分析等。

ELISPOT尽管主要用于T、B细胞分析,它还适用于任何想要在单细胞水平研究蛋白分泌的实验。该方法对于那些效应细胞的数量是至关重要的或者具有生物学意义的实验尤其适用,比如在LPS刺激PBMC后对分泌IL-6和IL-1β的单核细胞的量化分析;另外在分泌细胞数量特别少的研究中也尤其适用,比如浆细胞样树突状细胞,它在血液中的数量特别少,但是应用 ELISPOT能够很容易检测到其在激活后分泌的IFN-α。

例如
药物筛选:化合物和药物免疫学反应的筛选;
肿瘤免疫研究:已用于分析和评价在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。治疗前后特异性细胞免疫应答水平的检测,可有效的评估治疗效果,对于治疗和用药提供重要的参考信息。
移植免疫研究:移植中排斥反应的预测。

 

【AID酶联免疫斑点分析仪型号】

一、AID ELISPOT Reader Classic(基础款)

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自上市以来,全球已有超过1500家实验室正在使用AID公司的酶联免疫斑点分析仪,AID ELISPOT Reader硬件和软件完全符合欧盟CE 认证,FDA 21CFR part11规范、GMP/GLP标准。
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斑点图像采集与计数
全自动读板,自动采集各孔图像;自动计算斑点数量和斑点相关信息如大小、面积、光密度等。内置不同因子参数设置,直接调用;CountAID 功能协助优化读数参数,并具有智能参数记忆功能。
 

结果分析
直接判断阴阳性检测结果;诊断模块AIDiagnostic,适用于临床诊断用ELISPOT实验的结果判读,单独输出每例病人斑点图像和结果报告;统计分析各孔斑点分布、对比免疫反应强弱、细胞因子分泌量化比较等。
 

数据输出与质控
可输出单孔图像、任意孔及整板图像;多种保存格式,Excel, Txt, PPT等;输出数据可自定义包含斑点数,SFU,光密度强度, Activities,斑点分布图表等;包含质控模块,操作历史自动记录,符合GLP规范。

 

二、AID iSpot Reader 荧光酶联免疫斑点分析仪 (可见光/荧光)


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荧光双色ELISPOT分析——FluoroS pot,采用专利的荧光图像Overlay技术保证多色因子共分泌斑点准确识别,避免酶标双色检测中因不同细胞因子分泌量不均而引起的误判。4-8位滤光片轮,全自动切换,至少标配FITC和Cy3荧光滤光片,其他波长可加配。
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全自动判读
iSpot对板上每孔的各种颜色荧光斑点分别成像,例如检测FITC标记的IFN-γ分泌情况和Cy3标记的IL-2分泌情况,软件再自行将不同荧光图像叠加(Overlay),准确识别共分泌(IFN-γ&IL-2)细胞。整个过程全自动,无需人工干预。

 

性能稳定, 兼容扩展性好

高能激发保证微弱荧光信号检测,窄带滤光片保证特异性信号检测,多色扩展只需加配滤光片

 

技术先进性

最早在全球上市酶联斑点分析仪,1996年发明《应用ELISPOT方法检测血液细胞活性》的专利;唯一拥有《以荧光滤光片为基础进行荧光多色ELISPOT的检测系统》的专利PCT/EP2008/009112‐FluoroAID。

 

学术发表权威性

从荧光款2007年上市到现在,80%的荧光ELISPOT应用SCI文献是由AID发表的,被公认作荧光检测的更佳选择。

 

国际认可度高

与牛津大学Oxford免疫学实验室密切合作开发是其用于结核的酶联斑点(T-Spot)诊断的专用工具;国际艾滋病疫苗行动组织(IAVI)指定品牌;全球知名ELISPOT试剂盒开发实验室(如瑞典Mabtech)专用品牌。

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——德国AID中国一级代理商,北京泽平

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