LONZA Amaxa 4D-Nucleofector细胞核转染系统
——CRISPR基因编辑RNP高效转染动物细胞



 

德国进口LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统（原Amaxa 4D-Nucleofector核转仪），创新性地结合经典电穿孔技术和细胞特异性电转染液，实现了DNA、RNA(如crRNA、tracrRNA、gRNA、sgRNA)、RNP核糖核蛋白复合体、蛋白质（如Cas9核酸酶、切口酶、dCas9蛋白、Cas12a/Cpf1核酸酶）、小分子物质高效转染各类哺乳动物贴壁细胞和悬浮细胞、外泌体。

新款LONZA 4D核转仪由用于小规模转染的X模块（4D-Nucleofector X Unit）、贴壁细胞不经消化进行原位转染的Y模块（4D-Nucleofector Y Unit）、单一细胞大规模流式转染的LV模块（4D-Nucleofector LV Unit）、高通量筛选的96孔模块（原96-well Shuttle Device）组成。（Lonza另有独立384孔高通量核转仪，欢迎咨询）

LONZA 4D-Nucleofector技术不依赖于细胞有丝分|裂，不受细胞增殖的影响，可直接将外源基因导入细胞核中，即使是未分|裂的原代细胞（如静止的T淋巴细胞或神经元），也可以快速表达。

LONZA 4D-Nucleofector对质粒DNA转染效率高达90％，寡核苷酸（如siRNA）转染效率高达99％，面世20年来，已成功转染＞1200种细胞系、＞130种原代细胞，并在干细胞、免疫细胞、神经细胞等各类较难转染的细胞、以及外泌体电穿孔载药中获得了优秀的转染效果。

由于同种细胞系或原代细胞使用相同的转染条件（转染程序和转染试剂盒），LONZA 4D-Nucleofector可实现多种外源物质共转染，例如CRISPR-Cas9基因编辑时共转染2种sgRNA等。



图. GFP标记的质粒转染新生儿皮肤成纤维细胞，2小时后用3.5% PFA 固定，共聚焦显微镜可观察到GFP蛋白在细胞核内表达。

4D-Nucleofector细胞核转染方法特点

1.针对每种细胞优化的电脉冲参数，可将底物导入细胞质甚至是细胞核；
2.特殊配方的电转染液，同时提供高转染效率和细胞保护，提高细胞转染后存活率；
3.全球共享数据库，专业指导，从细胞来源、传代、培养条件、培养基、到转染后的培养技巧，已形成成熟的实验方案。



 

4D-Nucleofector核转染系统为基因治疗研究、免疫治疗研究、干细胞研究等提供了方便的工具。相比电穿孔在内的其他非病毒转染技术，更具优势：

-采用高分子聚合物电极，避免传统铝电极的离子毒害，维持细胞生理状态，提高存活率。
-转染后可快速观察实验结果，例如转染GFP后最快2小时可观察到蛋白。
-无需自己优化条件，拥有超过650种细胞类型的现成程序，可直接使用，全球共享数据库，超过1500条转染数据可供参考。
-可转染包括DNA、mRNA、miRNA、siRNA、RNP、肽、蛋白质、小分子化合物在内的多种底物。
-可用于难以转染的原代细胞、干细胞、神经元、细胞系，以及外泌体exosome
-可不用消化细胞，进行贴壁细胞的原位转染。
-灵活的转染规模缩放，可在低、中、高通量中轻松转移，实现2×10^4至1×10^9个细胞数量的轻松扩展。
-已在全球8000多家同行评议的出版物中发表。

最近，LONZA 4D-Nucleofector核转染系统已广泛应用于通过RNAi、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a进行的基因敲除研究、以及iPS诱导多能干细胞、CAR-NK、CAR-T的研究中，在包括功能和结构基因组学、药物发现以及基因和细胞疗法的研究中大放异彩。

4D核转仪结构和功能应用：

4D-Nucleofector细胞核转染系统采用模块化设计，可根据研究者的需求，自行组合数个模块形成一套完整系统。

1、C模块：4D-Nucleofector系统的控制单元，内置转染程序，将不同的功能单元（模块）整合为一个系统，以运行不同的应用程序。



 

2、X模块：用于悬浮细胞、或贴壁细胞消化后的小规模转染，转染细胞数量2×10^4至2×10^7。可同时转染2个100μL电转杯、1个16孔电转板条（每孔20μL），每个电转杯、每个孔可独立设置程序。另外在使用96孔模块时，也需要X模块。



 

3、Y模块：用于贴壁细胞不经消化的原位转染，可同时转染1个24孔电转板条（每孔350μL），每个孔可独立设置程序。



 

4、LV模块：用于同一种悬浮细胞、或同一种贴壁细胞消化后的大规模转染，转染细胞数量1×10^7至2×10^9。可使用1mL手动进样电转盘、或20mL连续进样电转盘。通常使用X模块小试摸条件，再用LV模块线性放大转染规模。



 

5、96孔模块：用于同时转染96个样品的细胞，转染细胞数量2×10^4至1×10^6。每个孔可独立设置程序。必须与X模块结合使用。


 

注：常用模块组合参考
常规小规模转染：C+X
贴壁细胞原位转染：C+Y
悬浮+贴壁细胞转染：C+X+Y
大规模转染：C+X+LV
摸索复杂转染条件：C+X+96孔

 

LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统参数
 

 

引用文献：

1.Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.Strecker J, et al. Nature (2019) 10(1): 212 
2.Gene correction for SCID-X1 in long-term hematopoietic stem cells.Pavel-Dinu M, et al. Nat Commun. (2019) 10 (1): 1634
3.Orthotopic replacement of T-cell receptor a- and ?-chains with preservation of near-physiological T-cell function.Schober K, et al. Nat Biomed Eng (2019) 10: 01 
4.Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells.Oh SA, et al. Curr Protoc Immunol (2019) 124(1): e69 
5.Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.Nguyen DN, et al. Nat Biotechnol (2019) 1: 1 
6.CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Hultquist JF, et al. Nat Protocols (2019) 14(1): 1-27 
7.Bacteria-free minicircle DNA system to generate integration-free CAR-T cells.Chen Cheng, et al. J Med Genetics (2019) 56: 10–17 
8.Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Shifrut E, et al. Cell (2018) 175(7): 1985-1971 
9.Guide Swap enables genome-scale pooled CRISPR-Cas9 screening in human primary cells. Ting PY, et al. Nat Methods (2018) 15(11)
10.Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.Castiglia S,et al.J Transl Med (2018) 16: 237 
11.A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Vakulskas CA,et al.Nat Med (2018) 24(8): 1216-1224
12.Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.Roth TL,et al.Nature (2018) 559: 405-9
13.Nucleofection with Plasmid DNA for CRISPR/Cas9-Mediated Inactivation of Programmed Cell Death Protein 1 in CD133-Specific CAR T Cells.Hu B,et al.Hum Gene Ther (2018)
14.Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.Seki A,et al.J Exp Med (2018) 215(3): 985-997
15.Improved Expansion and In Vivo Function of Patient T Cells by a Serum-free Medium.Medvec AR,et al.Mol Ther Methods Clin Dev. (2017) 7; 8: 65-74
16.Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.Hudecek M1,et al.Clin Exp Immunol (2017) 52(4): 355(80) 
17.CRISPR-Mediated Integration of Large Gene Cassettes Using AAV Donor Vectors.Bak RO,et al.Cell Rep (2017) 20(3): 750-756 
18.CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells.Zhang Y,et al.Frontiers in Immunology (2017) 1: 1-9 
19.CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells.Rupp LJ1,et al.Scientific Reports (2017) 7 (1): 737 
20.A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors.Park RJ, et al.Nat Genet (2017) 49(2): 193-203 

4D-Nucleofector细胞核转系统转染RNP引用文献
1. Seki A, Rutz S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 2018 Mar 5;215(3):985-997. doi: 10.1084/jem.20171626. Epub 2018 Feb 7. PMID: 29436394; PMCID: PMC5839763.
2. Oh SA, Seki A, Rutz S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Curr Protoc Immunol. 2019 Feb;124(1):e69. doi: 10.1002/cpim.69. Epub 2018 Oct 18. PMID: 30334617.
3. Naeimi Kararoudi M, Dolatshad H, Trikha P, Hussain SA, Elmas E, Foltz JA, Moseman JE, Thakkar A, Nakkula RJ, Lamb M, Chakravarti N, McLaughlin KJ, Lee DA. Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins. J Vis Exp. 2018 Jun 14;(136):58237. doi: 10.3791/58237. PMID: 29985369; PMCID: PMC6101749.
4. Farboud B, Jarvis E, Roth TL, Shin J, Corn JE, Marson A, Meyer BJ, Patel NH, Hochstrasser ML. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. J Vis Exp. 2018 May 25;(135):57350. doi: 10.3791/57350. PMID: 29889198; PMCID: PMC6101420.
5. Dewari PS, Southgate B, Mccarten K, Monogarov G, O'Duibhir E, Quinn N, Tyrer A, Leitner MC, Plumb C, Kalantzaki M, Blin C, Finch R, Bressan RB, Morrison G, Jacobi AM, Behlke MA, von Kriegsheim A, Tomlinson S, Krijgsveld J, Pollard SM. An efficient and scalable pipeline for epitope tagging in mammalian stem cells using Cas9 ribonucleoprotein. Elife. 2018 Apr 11;7:e35069. doi: 10.7554/eLife.35069. PMID: 29638216; PMCID: PMC5947990.
6. Daniel P. Dever1, Rasmus O. Bak1, Andreas Reinisch2, Joab Camarena1, Gabriel Washington1, Carmencita E. Nicolas1,
Mara Pavel-Dinu1, Nivi Saxena1, Alec B. Wilkens1, Sruthi Mantri1, Nobuko Uchida3, Ayal Hendel1, Anupama Narla4,
Ravindra Majeti2, Kenneth I. Weinberg1 & Matthew H. Porteus1. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.2016 Springer Nature doi:10.1038 (使用4D-Nucleofector LV大规模流式核转染系统转染RNP)


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