Attana Cell 200蛋白互作分析仪
——检测蛋白药物与肿瘤组织切片的亲和动力学
瑞典Attana公司制造的Attana Cell 200蛋白互作分析仪，是一种无需标记、可直接在细胞表面测量分子相互作用的生物传感器，其填补了传统生物传感器与基于细胞的分析方法之间的空白。
Attana蛋白互作分析仪依托于石英晶体微天平（Quartz Crystal Microbalance，简称QCM）技术，外加的交流电势使石英晶体在共振频率下震动，当分子流经晶体并与表面结合，振动频率会发生变化，其频率差异可以用来反映实时的分子相互作用。
自2010年上市以来，Attana Cell 200蛋白互作分析仪已广泛用于蛋白互作、蛋白细胞互作、抗体药研发等领域，赢得了包括大学、药企、CRO实验室的信任，与制药化工巨头Lonza集团、胰岛素研发明星诺和诺德等长期合作。
相比传统分子互作检测技术，Attana开创了直接在细胞层面进行实时原位分子结合动力学的检测方法，更准确地反映了体内环境的分子间互作，能够高质量、精确地研究其特异性、动力学和亲和力。
Attana Cell 200蛋白互作分析仪检测优势
1、可检测蛋白与细胞的相互作用
2、可检测蛋白与组织切片的相互作用
3、可检测细胞与细胞的相互作用
4、可使用粗制蛋白样品
Attana蛋白互作分析仪应用实例
用QCM技术检测蛋白药物与肿瘤组织切片的亲和动力学
长久以来，将癌症组织用甲醛固定石蜡包埋（FFPE）后做组织切片，进行免疫组化（IHC）分析，是癌症相关抗原的标准检测方法。但免疫组化本身很难定量抗体与癌症相关抗原结合的特异性和亲和力。Clausen等人建立了一套以Attana Cell 200 QCM技术为核心，直接在组织切片上进行实时原位分子亲和动力学的检测方法。
研究者直接在FFPE人胎盘组织、乳腺癌和前列腺肿瘤标本中，测定了rVAR2蛋白与它的胎盘样硫酸软骨素（pl-CS）受体之间的相互作用，发现rVAR2与FFPE人胎盘、肿瘤组织存在纳摩尔级的亲和力，与pl-CS阴性的正常组织无相互作用。
进一步用雄激素受体N-20的抗体（抗AR）对此方法进行评估，发现Attana得出的KD值与可用抗原表位的数量无关，表明Attana不仅能在组织标本上直接对抗原-抗体结合亲和力进行定量，还能评估抗体所能识别的抗原表位的数量。
基于这些结果，研究者认为Attana QCM技术不仅可用于挑选最佳生物制剂，还能用于开发新型高亲和力的药物。（Clausen, T. M., et al. Real-time and label free determination of ligand binding-kinetics to primary cancer tissue specimens; a novel tool for the assessment of biomarker targeting. Sens Biosensing Res. 2016; 9: 23-30.）
图1.Attana Cell 200蛋白互作分析仪与COP-1检测芯片。
图2.免疫组化鉴定为阳性的甲醛固定石蜡包埋组织样品被切成5μm厚的薄片，并固定在COP-1芯片中心。
图3.（b）Attana测定出rVAR2蛋白与胎盘组织的KD值为4.27nM，具有高亲和力。（c）当添加了能抑制rVAR2粘附于胎盘组织的CSA溶液后，rVAR2蛋白与胎盘组织的结合曲线不再有明显的结合点和解离点。
图4.（a）免疫组化结果显示，与作为正常组织对照的扁桃体组织切片相比，rVAR2蛋白与乳腺癌、前列腺肿瘤组织切片有强相互作用，进一步用Attana测定其KD值分别为8.9nM和6.65nM，而与扁桃体组织的结合曲线无明显的结合点和解离点，无法测出其KD值。（b和c）用V5-FITC的抗体对rVAR2蛋白进行定位，进一步验证了Attana得到的结果，即rVAR2蛋白与前列腺肿瘤组织切片强结合，而不与扁桃体组织结合。证明Attana能准确对组织切片上抗原-抗体的亲和力进行定性和定量。
图5.检测发现纯化的胎盘样硫酸软骨素（pl-CS）受体与rVAR2蛋白的KD值为3.6nM，具有强结合，证明Attana可准确检测纯化蛋白间的相互作用。
图6.将乳腺癌细胞(SKBR3)、前列腺癌细胞(LNCap)与中国仓鼠卵巢细胞（CHO）相比，免疫组化和Attana的结果一致，乳腺癌细胞与前列腺癌细胞均检测到细胞与rVAR2蛋白有着很强的亲和力。
图7.高表达AR的Lncap细胞与AR抗体有强的亲和力，而雄激素非依赖的PC3与AR抗体的亲和力相对较弱。这一结果进一步在细胞水平上证明了Attana具有广泛的兼容性。
图8.采用Attana对AR抗体与FFPE组织切片的亲和力检测结果，与免疫组化结果一致，即免疫组化阳性的FFPE前列腺癌组织，对AR抗体有强的亲和力，免疫组化阴性的FFPE胎盘组织，对AR抗体无相互作用。这一结果在组织切片水平上也证明了Attana能有效监测抗体与切片的结合。
实验操作总结：
1、组织切片如何固定在COP-1芯片上？
Attana的COP-1芯片在室温用聚L-赖氨酸溶液包被5分钟。包被后，用PBST冲洗芯片，并在室温干燥2小时。将甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织样品切成5μm厚的薄片，并贴在芯片上，60℃烘烤1h。
2、脱蜡和抗原修复
将COP-1芯片上的组织样品浸没在EZprep溶液中，65℃水浴30min进行脱蜡。之后PBS洗3次。再在95℃下，用pH6.0的10mM柠檬酸钠、0.05％吐温溶液浸泡30min进行抗原修复。
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——Attana中国授权代理商，北京泽平
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