NEB DNA连接酶
——重组T4 DNA连接酶、T4快速连接酶、T7 DNA连接酶

 
北京泽平代理的美国进口NEB DNA连接酶，包括T4 DNA连接酶、T4 DNA 快速连接酶试剂盒、T7 DNA连接酶、电转连接酶等，覆盖平末端连接酶、T/A连接酶、无缝克隆连接酶、快速连接酶等广泛类型，为生命科学实验中分子克隆相关应用提供丰富、高效的连接酶选择。

NEB T4 DNA 连接酶作为NEB优势产品，连接效率高、稳定性强，满足传统酶切克隆、Golden Gate 组装无缝克隆、TA克隆在内的各类克隆需求，成为DNA连接酶的理想选择。



①高性能——NEB T4 连接酶可实现10min连接粘性末端、2h连接平末端（或高浓度连接酶10min连接平末端）、5min快速连接粘性末端或平末端等，连接性能非常高效。

②种类丰富——NEB针对不同实验需求进行配方优化，提供耐盐、耐热、电转连接酶等多种类型，以应对复杂实验需求。

③质控严格——NEB DNA 连接酶具备非常高的酶纯度、连接活性高、无其他酶干扰、质控严格，产品质量报告COA除提供连接酶活性、SDS-PAGE纯度外，更对内切酶、外切酶活性进行验证，保证产品质量高水准。




1、NEB T4 DNA 连接酶

NEB T4 DNA 连接酶（T4 DNA Ligase，货号M0202），是重组连接酶，可连接平末端、粘性末端，还可修补双链DNA和部分DNA/RNA 杂交链中的单链切刻位点，适用于高复杂性文库克隆。室温（20~25℃）条件下，连接粘性末端，在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA 连接酶，反应10min；连接平末端，在20µl的反应体系中加入1µl的T4 DNA 连接酶，反应2h，或者加入1µl高浓度的T4 DNA 连接酶反应10min。可提供GMP级别产品。

 
2、NEB快速连接试剂盒

NEB快速连接试剂盒（Quick Ligation Kit，货号M2200），作为快速T4连接酶，对反应体系进行优化，在室温条件下（25℃），可在5min内连接粘性末端或平末端DNA片段，时间过长并不会提高连接效率。


图. 时间连接进程。LITMUS 28i 载体经EcoRV（平末端）或HindIII（粘性末端）切割后，用小牛肠磷酸酶进行处理和凝胶纯化。使用NEB快速连接试剂盒将HaeIII消化后的ΦX174 DNA插入片段（平末端）和HindIII消化后的λ DNA 插入片段（粘性末端）连接到各自的载体中，插入片段与载体的比例3:1。将连接产物转化到化学感受态大肠杆菌DH-5α细胞中，并在37℃条件下LB-amp平板上过夜培养。

 
3、NEB平末端/TA连接酶预混液

NEB平末端/TA连接酶预混液（Blunt/TA Ligase Master Mix，货号M0367），即用型2×预混液，内含T4 DNA 连接酶、连接增强剂和经优化的反应缓冲液，专为提高平末端和单碱基突出末端的连接效率和转化效率而设计。


图. 平末端/TA连接酶预混液提高了反应通常较慢的末端连接的产量。在所有反应条件下，使用高浓度T4 DNA 连接酶、快速连接试剂盒、平末端/TA预混液的最终连接产物产量。切刻位点、粘性末端和3'单碱基突出末端的底物温育15min进行连接； 5'单碱基突出末端的底物温育1h进行连接。

 
4、NEB瞬时粘性末端连接酶预混液

NEB瞬时粘性末端连接酶预混液（Instant Sticky-end Ligase Master Mix，货号M0370），即用型2×预混液，内含T4 DNA 连接酶、连接增强剂，优化了酶和缓冲液组分的比例，专为瞬时连接粘性末端（2~4 bp）和提高转化率设计。当DNA量少且浓度较低时，仍可进行亚克隆连接，节省宝贵的DNA样本，并且无需稀释，可直接转化到多种化学感受态大肠杆菌菌株中。

 
5、NEB电转连接酶

NBE电转连接酶（ElectroLigase，货号M0369），由T4 DNA 连接酶和经优化的即用型2×反应缓冲液组成，内含连接增强剂，不含PEG，专业用于促进各种DNA末端（平末端、粘性末端、TA末端）的高效连接和电转化，可在低DNA浓度的小体系中进行亚克隆连接，节省宝贵的DNA样品，无需纯化或稀释，反应液可直接转化到多种电转感受态大肠杆菌菌株中，也可用于化学感受态大肠杆菌菌株。


图. 使用电转连接酶建立连接反应体系，内含等量的（20ng载体和3倍摩尔量的插入片段）平末端（A）、T/A（B）或粘性末端（C）载体/插入片段，并温育如图所示的相应时间。热失活后，每个反应取2μl直接转化到NEB 10-beta 电转感受态大肠杆菌中。取50μl的复苏菌液（某些情况下需要稀释）涂到选择性培养板上，37℃ 温育过夜。最后统计菌落。


6、NEB Hi-T4 耐热DNA连接酶

NEB Hi-T4 耐热DNA连接酶（Hi-T4 DNA Ligase，货号M2622），是经基因工程改造的T4 DNA 连接酶的变体，改善了热稳定性，可在高达50℃条件下连接平末端和粘性末端，还可修补双链DNA、RNA和一些DNA/RNA杂交链中的单链切刻。


图. Hi-T4耐热DNA连接酶的耐热性优于T4 DNA 连接酶。400单位T4 DNA 连接酶或Hi-T4耐热DNA连接酶在无DNA底物的1×T4 DNA 连接酶缓冲液中，以45℃预温育指定时长。加入0.12μM HindIII（粘性末端）荧光标记片段，并以37℃温育15min，测试连接酶的剩余活性。连接产物经毛细管电泳分析。T4 DNA 连接酶在45℃时逐渐失去活性，而Hi-T4耐热DNA连接酶即使在45℃温育72h后在连接粘性末端底物上仍保持完整活性。


图. Hi-T4耐热DNA连接酶对更高温度循环的耐受性优于T4 DNA 连接酶。在1×T4 DNA 连接酶缓冲液中，分别用1000单位T4 DNA 连接酶或Hi-T4耐热DNA连接酶与DNA（1μg pBR322）进行循环温浴。循环温度设置为：42℃（A）或50℃（B）5min，16℃ 5min。在指定的循环次数（0、15、30、45或60次）之后，以荧光标记的粘性末端底物（HindIII突出末端，25℃时10min）检测连接酶活性。连接产物经毛细管电泳分析。显示了连接酶的剩余活性（相对于0循环数据点）。
A：在16℃和42℃条件下，T4 DNA 连接酶经过循环后逐渐失去活性（金黄线），而Hi-T4耐热DNA连接酶在此温度条件下经过60次循环后仍保持活性（橙红线）。
B：在16℃和50℃的15次循环后，T4 DNA 连接酶完全失去活性（金黄线），而Hi-T4耐热DNA连接酶在此温度条件下经过60次循环后仍保持约60%的活性（橙红线）。


7、NEB Salt-T4 耐盐DNA连接酶

NEB Salt-T4 耐盐DNA连接酶（Salt-T4 DNA Ligase，货号M0467），是经基因工程改造的T4 DNA 连接酶的变体，具备更强的耐盐性，反应体系中高达300mM的盐浓度不影响连接酶活性。该酶不仅能够连接平末端和粘性末端，还可修补双链DNA和一些DNA/RNA杂交链中的单链切刻。


图. 与T4 DNA 连接酶相比，Salt-T4耐盐DNA连接酶对粘性末端底物表现出更高的耐盐性。取400单位的T4 DNA 连接酶或Salt-T4耐盐DNA连接酶与0.12μM荧光标记的HindIII酶切片段（粘性末端），在盐量梯度（0~1000mM NaCl）的1×T4 DNA 连接酶缓冲液中25℃温育10min。连接产物经毛细管电泳分析。当盐浓度超过200mM时，T4 DNA 连接酶的活性迅速丧失；当盐浓度高达500mM时，Salt-T4耐盐DNA连接酶连接粘性末端底物时仍保留>60%的活性。


8、NEB T3 DNA 连接酶

NEB T3 DNA 连接酶（T3 DNA Ligase，货号M0317），来源于T3噬菌体，是一种ATP依赖型双链DNA连接酶，对NaCl的耐盐性是T4 DNA 连接酶的2倍，可用于粘性末端、平末端、切刻位点的连接，与T4 DNA 连接酶一样，在反应中加入PEG 6000 可以提高平末端连接效率。


9、NEB T7 DNA 连接酶

NEB T7 DNA 连接酶（T7 DNA Ligase，货号M0318），来源于T7噬菌体，是一种ATP依赖型双链DNA连接酶，仅可连接粘性末端，不能连接平末端，适用于当DNA平末端和粘性末端同时存在，而仅需连接粘性末端时。


图. T7 DNA 连接酶不会连接平末端DNA片段。每种底物取200ng，每种连接酶取1μl，建立包含平末端片段（Φ X174 DNA-HaeIII Digest）和粘性末端片段（λ DNA-HindIII Digest）的连接反应体系，并在相应的反应缓冲液中以25℃温育30min。添加6×上样染料立即终止反应，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，再利用溴化乙锭进行染色。


10、NEB Taq 高保真DNA连接酶

NEB Taq 高保真DNA连接酶（HiFi Taq DNA Ligase，货号M0647），由热稳定DNA连接酶和添加剂组成，在高温（37~75℃）范围内具有活性，多次热循环后仍保持活性，能以非常高的保真度高效连接DNA切刻，适用于依赖连接酶的IVD技术（如连接酶链反应LCR、连接酶检测反应LDR），可降低错配连接。

Taq高保真DNA连接酶能高效区分连接处两侧的碱基是否正确配对，适用于3'或5'错配检测，可以更好地识别连接反应供体和受体，精确检测SNP和其它等位基因变异。相比之下，其它热稳定连接酶只对3'错配有效。Taq高保真DNA连接酶可提供无甘油剂型。Taq高保真连接酶不能替代T4 DNA 连接酶，不适用于克隆应用或接头连接/NGS文库制备。


11、NEBridge连接酶预混液

NEBridge连接酶预混液（NEBridge Ligase Master Mix，货号M1100），专用于Golden Gate 无缝克隆，作为即用型3×预混液，含有T4 DNA 连接酶和连接增强剂，可与多种NEB IIS型限制性内切酶搭配使用，进行高效率、高保真的Golden Gate 组装，支持在单个反应中同时进行2~52个片段的组装，可用于单片段克隆和文库构建。




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