IDT NGS二代测序文库均一化试剂盒
——获得高度稳定且均一化处理的DNA/RNA测序文库

 
北京泽平代理的美国进口IDT xGen Normalase 文库均一化试剂盒，采用了一种新型酶促文库均一化处理技术，可对Illumina测序仪测序前的DNA或RNA文库进行均一化处理。通过IDT文库均一化试剂盒，上机前无需进行单个文库浓度检测，可得到优化的簇密度和更均衡的文库。IDT文库均一化处理试剂盒可搭配常规建库实验流程，不仅能缩短实验整体的操作时间，还能提高NGS文库上机浓度的精确性，实现混合文库间测序数据量的均一性。IDT文库均一化处理实验流程包括文库的非偏好性选择、酶均一化反应，在文库扩增中使用带有Normalase标记的引物，可稳定得到3倍于目标均一化浓度的产量。例如上机前文库浓度需要均一化为2nM或4nM的标准文库产量，则IDT均一化反应前文库浓度至少分别为6nM或12nM（20ul体积）。该实验过程中不需要增加额外PCR步骤，仅需将常规文库扩增引物替换成带有Normalase标记的测序通用引物或带有样本标签的引物。IDT xGen Normalase 文库均一化试剂盒为高通量实验室提供了快速、可扩展的文库标准化工作流程。


优势

①节省时间，提高通量：统一的样本处理过程，生成平衡均一的混合文库；

②减少文库测序差异，降低测序费用：得到更平衡的混合文库，允许更多的样本混合上机，降低测序成本；

③适用多种工作流程，设计灵活：兼容多种文库制备方法，获得均一平衡的测序数据。



图. IDT xGen Normalase 文库均一化试剂盒的工作流程始于建库接头连接反应后，工作流程根据使用全长或短接头而不同。通过Normalase PCR，将文库扩增到均一化处理反应所需最低数量，然后进行下游的酶均一化处理。在此过程中，如连接反应中使用全长接头，PCR扩增需使用带有Nomalase标记的测序通用引物；如使用非全长接头，则需使用带有Normalase标记的样本标签作为扩增引物。将扩增好的单个NGS文库分别进行15分钟Normalase l 孵育，此反应过程使用酶促法，可以无偏好性地选择指定摩尔浓度的NGS文库。之后，将每个文库等体积的混合到一管中，进行15分钟Normalase II 孵育，酶促法将每个NGS文库标准化到指定的摩尔浓度。实现上机测序前，得到平衡且均一化的NGS混合文库。

 

 
一、不同片段大小，也可得到高度稳定且均一化测序文库



表. 使用IDT Normalase试剂盒将文库均一化处理成4nM，上样浓度为12pM，得到和预期一致的簇密度（Illumina MiSeq测序，v2版本试剂）。
 
 

 
二、相比传统上机定量方式，可得到数据量更均一的混合文库



图．测试分别来自于两名实验者（n=16/每名实验者）的32个样品，使用IDT xGen DNA Library Prep EZ 试剂盒构建文库。实验样本为NA12878 gDNA，起始量为1~250ng。Normalase PCR后的文库使用qPCR方法定量，保证文库达到Normalase反应所需最低阈值。"qPCR"：基于qPCR定量结果，对文库进行均一化处理、混样和测序；“Normalase"：同样样品使用Normalase试剂盒，对文库进行混样、均一化处理和测序。比较两种方法每种接头测序产生数据百分比（Illumina MiSeq v2的50循环测序试剂盒）。结果显示： qPCR混合文库中文库测序数量变异系数（CV）为22.5%，而Normalase混合文库池的变异系数为9.4%（中位线为95%的置信区间）。




图. 10ng NA12878 gDNA，使用IDT xGen DNA Library Prep EZ 试剂盒构建96个文库，搭配IDT xGen CDI接头引物进行扩增。文库混样、均一化处理前，使用Qubit定量结果做等体积的文库混样，之后使用Illumina MiSeq V2测序试剂盒上机测序（50个循环），通过每种接头产生测序数据量百分比进行比较。均一化反应之前混合文库池CV为15.5%，证明Normalase引物的扩增结果稳定、重复性好。将相同的文库均一化处理到4nM，并使用Illumina MiSeq V2 50循环测序试剂盒上机测序。均一化处理后，文库CV降为7.7%，证明通过IDT xGen Normalase 可得到更加均一化的混合文库（中位线为95%置信区间）。

 


图. 针对不同GC%含量基因组细菌的测序覆盖度及冗余率结果

使用IDT xGen DNA Library Prep EZ 建库试剂盒，起始量为100ng DNA，包含三种不同比例混合的参考菌株（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链酶球菌）。片段化DNA至350bp，建库时搭配全长的Y型接头进行连接，使用Normalase标记的通用测序引物扩增3、5或7个循环。依据qPCR定量结果进行文库混合，并使用Illumina MiSeq PE150 测序。测序结果显示，不同GC%含量基因组细菌的测序覆盖度及冗余率没有显著差异。




图. 使用IDT文库均一化试剂盒，对插入片段大小即菌种覆盖度评估无影响

将5ng的MSA-1000样品（GC%基因组含量不同的10种等比例混合菌株），用IDT xGen DNA Library Prep EZ 试剂盒构建文库，分别用IDT Normalase标记引物（紫红色）和IDT普通引物（蓝色）对两个文库进行扩增。使用IDT均一化试剂盒或Qubit将文库均一化处理为4nM。进行Illumina MiniSeq 平台高通量上机（PE-150）测序。实验结果显示，所构建的基因组文库中（由不同GC%含量的细菌组成），经IDT均一化处理的文库，仍保持着稳定插入片段大小（A）和高基因组覆盖度（B）。

 

 
三、文库均一化试剂盒的使用，不影响原有RNA测序数据分析结果

平行对比RNA文库进行上机前均一化处理使用IDT文库均一化试剂盒（n=2）、qPCR方法（n=2）的效果。4个RNA-seq文库（50ng人脑mRNA样本）分别使用带有Normalase标记的双端样本标签、常规双端样本标签进行文库制备。将带有常规样本标签的文库（标记为"1"和"2"号文库），按qPCR定量结果进行文库均一化及混样。将带有Normalase标记的文库（标记为"3"和“4号文库），在文库制备完成后，搭配IDT文库均一化试剂盒，将RNA文库均一化处理至4nM。通过MiniSeq （2×150）上机测序，证明IDT文库均一化试剂盒对RNA-seq分析结果无影响。将各文库均一化处理至4nM后上机测序，使用STAR、Picard及RSeQC进行比对、进行RNA-sec数据分析。韦恩图结果显示，每个样本中检测到的前1000个转录本结果没有显著差异。


 

表. 相同RNA文库，分别使用qPCR文库定量、IDT Normalase文库均一化试剂盒进行文库均一化处理，其RNA-seq数据分析结果比较。由于IDT试剂盒使用非偏好性的酶促方法进行文库均一化处理，因而两种文库均一化处理有着近似的RNA-seq分析结果，与预期相符。
 



表. 相同RNA文库，分别使用qPCR文库定量、IDT Normalase文库均一化试剂盒进行文库均一化处理，其1000个高表达转录本分析结果比较。由于IDT试剂盒使用非偏好性的酶促方法进行文库均一化处理，因而二者的1000个高表达转录本RNA-seq分析结果近似，与预期相符。

 
图. 韦恩图显示每个样本中检测到的前1000个转录本结果没有显著差异
 


 

 
IDT文库均一化试剂盒优势

①可灵活调整均一化处理后文库浓度，只需样本扩增后浓度超过最少文库量阈值，即可保证最终所需文库浓度均一化；

②处理后的均一化文库浓度为4nM，选择使用≥6nM均一化工作流程时，最终文库浓度为2nM；

③混合文库间测序变异系数系数≤10%；

④试剂盒兼容性强，可兼容全长测序接头或短接头的建库流程；兼容非靶向富集的工作流程，制备的文库可直接测序（如全基因组测序或全转录组测序）；兼容杂交捕获流程，即靶向富集完成后上机前的文库均一化。需保证均一化反应前，有稳定的文库产量（20μL反应体系中文库摩尔浓度≥6nM或≥12nM），以得到标准的2nM/4nM文库量；

⑤兼容IDT xGen接头、IDT xGen Normalase CDl引物、IDT xGen Normalase UDI引物；

⑥兼容Illumina测序平台，并可获得一致的测序结果。
 

 

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