Attana生物大分子互作分析仪

——抗体无需纯化，即可筛选鉴定杂交瘤上清液

在鉴定抗体-抗原相互作用之前纯化抗体、标记抗体，通常非常耗时，并且存在需要优化实验条件和产量低等问题。瑞典Attana生物大分子互作分析仪和Attana抗体捕获试剂盒可以减少这些问题。在这里，展示了Attana的一种抗小鼠抗体的芯片，它能够从原材料中捕获抗体，随后详细研究了抗体与其抗原之间相互作用的动力学。

北京泽平代理的Attana生物大分子互作分析仪，利用石英晶体微天平(QCM)技术，对分子相互作用进行实时、无标记测量。当分子被添加到传感器表面或从传感器表面移除时，共振频率的变化对应于表面质量的变化。通过将目标分子固定到传感器表面，并使相互作用的分子在表面上流动，可以实时研究相互作用。实时信息可以提供关于相互作用的动力学、亲和力和特异性数据。

实验目标
首先，从粗样品（如杂交瘤上清液）中筛选小鼠IgG抗体，确定结合抗原的解离速率。然后，确定在筛选中选择的抗原和抗体之间的详细动力学速率常数和亲和力。

实验方法
按照小鼠免疫球蛋白捕获试剂盒中提供的说明，以1xHBST(10mM HEPES缓冲盐，0.005%吐温20，25微升/分钟，22℃)为流动相，将小鼠免疫球蛋白捕获分子固定在Attana羧基传感器芯片表面，然后从杂交瘤上清液中捕获小鼠IgG抗体，然后实时研究它们各自与抗原的相互作用特性。使用5微克/毫升的抗原浓度来确定解离速率常数，使用1.25至20微克/毫升的浓度来进行详细的动力学表征。在每个相互作用循环后，表面被再生，恢复最初的小鼠IgG捕获能力。

使用Attester3.1软件收集数据，然后在Attester Evaluation3.1中进行处理。Attester Evaluation软件中嵌入的解离速率筛选工具用于识别抗原解离速率常数最低的抗体。使用Attester Evaluation和Clamp XP软件计算和获得详细的动力学数据。

实验结果
针对一种抗原，从产生小鼠IgG的杂交瘤培养物中筛选了11种抗体的解离速率常数。首先，使用小鼠IgG结合分子从各自的上清液中捕获IgG。此后，将抗原注射到表面上，并监测与捕获的抗体的相互作用。使用Attester Evaluation软件的解离速率筛选工具用于生成一个列表，突出显示最稳定的相互作用(低解离速率常数)。参见图1的结果图和收集的数据。

图1、11种不同抗体的抗原相互作用曲线汇总。对于每个相互作用周期，首先注射一个含有特定抗体的杂交瘤上清液以捕获抗体，随后注射抗原。图中还显示了Attester Evaluation软件的解离速率筛选工具。该表给出了11个确定的解离常数。阈值功能可以用于突出显示解离速率常数低于某个值的抗体。如图所示，低于1.8 x 10-4的解离速率常数以蓝色突出显示 。

选择具有最低解离速率的杂交瘤，用于进一步抗体-抗原相互作用的详细动力学分析。在该步骤中，使用了与解离速率筛选相同的芯片。在保持抗体捕获水平恒定的同时，改变抗原浓度，通过使用全局曲线拟合算法分析数据来得到详细的动力学速率常数(即相互作用的kon、koff和KD，图2)

图2、(A)动力学速率常数kon 和koff的测定。相互作用数据用黑色表示，动力学模型的拟合用红色表示。(B)捕获分析实验设置的示意图。(C)速率常数。

实验结论
1、利用Attana生物大分子互作分析仪，开发了一种实时、无标记的从杂交瘤上清液中捕获小鼠抗体的方法。同样的方法可以用于捕获人类免疫球蛋白。
2、导出相互作用、结合(Kon)和解离(Koff)速率常数的动力学信息，可以计算分子之间的亲和力(KD)。
3、实现了直接从粗样品（如杂交瘤上清液）中快速筛选多达192个抗体-抗原对，而无需纯化或标记抗体。
4、该方法使用通用的固定和再生条件，并且不需要预先纯化抗体，可以显著节省时间、提高效率。

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——Attana中国授权代理商，北京泽平

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