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Attana生物大分子互作分析系统

——实现多克隆抗体的动力学和亲和力的快速检测计算


抗体生产的主要目标是获得用于实验、诊断测试或治疗的高滴度、高亲和力抗血清。检测和监测这些多克隆抗体的纯化耗时且麻烦。本实验实例表明,Attana生物大分子互作分析系统,可快速鉴定分别针对多肽、蛋白质抗原产生的多克隆抗体。多克隆抗体本质上是抗体的混合物,具有各自的动力学特征,并且很可能还具有抗原表位特异性的差异。由于这种异质性,导出的速率常数和计算的亲和力应被视为不同亚群的平均值。


Attana生物大分子互作分析系统,利用石英晶体微天平(QCM)技术,对分子相互作用进行实时、无标记测量。当分子被添加到传感器表面或从传感器表面移除时,共振频率的变化对应于表面质量的变化。通过将目标分子固定到传感器表面,并使相互作用的分子在表面上流动,可以实时研究相互作用。实时信息可以提供关于相互作用的动力学、亲和力和特异性数据。

Attana生物大分子互作分析系统 北京泽平

实验目的
确定两种不同的多克隆抗体与其各自的多肽和蛋白抗原之间相互作用的动力学。


实验方法
1、多克隆抗体和生物素化肽抗原之间相互作用的动力学测定
生物素化肽(1纳克/毫升)以25微升/分钟的流速,用PBST(含0.005%吐温20的10mM磷酸盐缓冲液)作为流动缓冲液,固定在链霉亲和素包被的Attana生物素芯片上。将识别生物素化肽抗原的纯化多克隆抗体稀释至10、5、2.5、1.25 微克/毫升。随后注射到芯片表面上。在每次抗体注射之间,通过一次注射甘氨酸-盐酸(pH 2.5)使表面再生,接触时间为30秒。

Attana生物大分子互作分析系统 北京泽平

2、多克隆抗体和15kDa蛋白质抗原之间相互作用的动力学测定
在Attana生物大分子互作分析系统中平衡Attana羧基传感器芯片,通过EDC/sulfo-NHS介导的胺偶联,使用10mM HEPES作为23℃和25微升/分钟的运行缓冲液,将50微升蛋白质抗原(0.1μg/ml,溶于HAc pH 5.0中)固定在表面上。用PBST做流动相,以5、2.5、1.25、0.625和0.3125μg/ml注射多克隆抗体进行相互作用实验。表面顺序用100mM H3PO4再生45秒、200mM氢氧化钠再生30秒。在每个浓度系列之前和之后注射缓冲液,并用作参考空白。

 

数据由Attester3.0版收集,随后在Attester Evaluation3.0版中进行处理。使用Attester Evaluation3.0版和Clamp XP获得动力学数据。对于速率常数计算,使用150kDa作为多克隆抗体的分子量。


实验结果
两种不同的多克隆抗体血清(一种针对肽,另一种针对蛋白质),及其抗原之间的相互作用所获得的数据如图1和图2所示。所用多克隆抗体的最高浓度为10和5微克/毫升,产生的频率响应分别为12和20赫兹。为了控制相互作用不受传质限制的影响,测试了几种流速,发现25升/分钟适用于相互作用研究。  

 

在统计了所有数据,结合曲线的全局动力学分析,使用Clamp XP软件,计算出针对肽抗原的多克隆抗体的KD为7.2nM(图1),针对蛋白质抗原的多克隆抗体的KD为0.3nM(图2)。

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图1:多克隆抗体与生物素化肽抗原的结合。(A)结合曲线(黑色)、结合与简单的1:1结合模型的拟合(红色)。(B)实验设置的示意图。(C)导出的速率常数和由koff /kon计算的KD 。

 

Attana生物大分子互作分析系统 北京泽平

图2:多克隆抗体与胺偶联蛋白抗原的结合。(A)结合曲线(黑色)、结合与简单的1:1结合模型的拟合(红色)。(B)实验设置的示意图。(C)导出的速率常数和由koff /kon计算的KD 。


如上所述,多克隆抗体样品的异质性,很可能导致不同的亲和力。这也提示将简单的动力学相互作用模型与数据相匹配的可能性。图1中的A图,显示在解离阶段的第一部分有相当高的解离速度,表明亚群与抗原形成相对不稳定的复合物。此后,解离速率稳定下来,代表与抗原形成相对稳定复合物的亚群,并且从这部分解离阶段获得的数据显示与1:1相互作用模型有更好的一致性。


此外,如果使用传感器表面固定抗原的方式进行实验,为了表征二价或多价抗体,必须非常小心地测量亲和力而不要测结合总亲和力。我们以前的数据显示,使用Attana羧基或生物素传感器芯片,可以非常精确地滴定表面抗原密度,以避免由高表面密度引起的总亲和力效应。这是在上述实验开始之前对两种抗原进行的。


实验结论
1、本实验使用Attana生物大分子互作分析系统,开发了一种方法,可以实时、无标记地测量多克隆抗体与多肽和蛋白质抗原的相互作用。
2、通过使用该方法,可以导出相互作用的动力学信息,例如结合(kon)和解离(koff)速率常数,并计算相互作用的亲和力。
3、该方法可用于监控多克隆抗体的纯化效率、比较不同免疫的效果、监测滴度变化等。
4、该实验可针对固定的抗原筛选多克隆抗体,节省时间且成本低。

 

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——Attana中国授权代理商,北京泽平

 

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