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使用HUVEC细胞进行血管生成实验,并用LONZA核转仪转染anti-VEGFR2 siRNA,评估其抗血管生成的效果
发布时间:2018年01月02日

Srinivasan Kokatam1, Kanchan Tiwari1, Jenny Schroeder2, Andrea Toell2, Lubna Hussain3, Preeti Kapoor1.

1. Lonza India Pvt Ltd, Hyderabad, India; 2. Lonza Cologne GmbH, Cologne, Germany; 3. Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD, U.S.A.

实验材料:

英文名

中文名

品牌

货号

single donor Clonetics™ HUVECs

脐静脉内皮细胞,单一供体

LONZA Clonetics

C2517A

EGM™ 2 Media

血管内皮细胞培养基

LONZA

CC-3162

ViaLight™ Plus BioAssay Kit

细胞活力检测试剂盒

LONZA

LT07-221

Matrigel

基质胶

Corning

356237

4D Nucleofector

核转仪

LONZA

C+X+96模块

P5 Primary Cell Nucleofector Kit

核转试剂盒

LONZA

V4XP-5024

V4XP-5032

Calcein AM

 

Life Technologies

C3100MP

VEGFR2 ELISA

VEGFR2的ELISA检测试剂盒

R&D Systems

DYC1780-5

 

培养基配方:

 

实验流程简介:

1. 使用pmaxGFP质粒进行进行预实验,优化HUVEC细胞核转条件;

2. 检测核转条件对HUVEC细胞的Tube formation是否有影响;

3. 转染siRNA,确定对细胞活力影响最小的最佳浓度,确定检测蛋白表达降低的最佳时间点;

4. 评价siRNA对HUVEC细胞Tube Formation的影响。

 

实验结果:

图1. HUVEC细胞转染GFP质粒,转染效率约为82%,对细胞形态无明显影响:

图2. HUVEC细胞进行核转后,对Tube formation无明显影响:

图3. Anti-VEGFR2 siRNA转染后的细胞对VEGF无反应,证明siRNA发挥作用。

 

参考文献:

1. Timar, J. et. al. (2001) Angiogenesis-dependent diseases and angiogenesis therapy. Pathol. Oncol. Res.7 (2): 85-94

2. Murga M1, Fernandez-Capetillo O, Tosato G. (2005) Neuropilin-1 regulates attachment in human endothelial cells independently of vascular endothelial growth factor receptor-2. Blood 105 (5): 1992-9

3. Yang, S, Xin, X, Zlot, C et. al. (2001) Vascular Endothelial Cell Growth Factor-Driven Endothelial Tube Formation Is Mediated by Vascular Endothelial Cell Growth Factor Receptor-2, a Kinase Insert Domain-Containing Receptor. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21: 1934-1940

4. Zumbansen M, Altrogge L, Toell A, Leake D, Muller-Hartmann H (2009) First siRNA Library Screening in Difficult-to-Transfect HUVEC and Jurkat Cells. White paper.

5. Zeitelhofer M, Vessey JP, Xie Y, Tubing F, Thomas S, Kiebler M, Dahm R (2007) High-efficiency transfection of mammalian neurons via Nucleofection. Nat. Protocols 2: 1692–1704

6. Kapoor, R., Reddy, V. and Kapoor, P. (2014) Tube Formation Assay with Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Resource Notes, 2014: 9-12.

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