摘要
近年来，COVID-19、流感和 RSV 等上呼吸道病毒的大规模流行，凸显了开发能准确模拟免疫细胞与肺上皮细胞等多细胞系统间相互作用的生理相关模型的迫切需求。这类模型是药物测试和机制分析的重要基础。
本文介绍了我们利用 Lonza 的 B-ALI™（支气管气液界面）系统，将免疫细胞（外周血单个核细胞，PBMC）与呼吸道上皮细胞（正常人支气管上皮细胞，NHBE）共培养，并成功优化该模型的过程。
该模型在气液界面形成了具有生理功能的、极化和分化的上皮膜（形成纤毛和紧密连接），液态腔中的免疫细胞亦表现出正常的 T 细胞激活反应。
通过病毒抗原刺激 T 细胞，我们验证了该共培养体系可作为病毒诱导炎症的生理相关模型：T 细胞 CD69 表达升高，炎症因子颗粒酶 B、TNF-α 和 IL-6 增加；同时 NHBE 膜明显变薄，提示 PBMC 的炎症反应可能触发了上层上皮的坏死。
总体而言，该模型为研究免疫系统与肺上皮之间的相互作用提供了简便且生理相关的系统。
引言
上呼吸道病毒（COVID-19、流感、RSV）的暴发，以及 FDA 对药物研发中无动物源（xeno-free）模型的重视，使人们对能更好模拟呼吸系统复杂生理过程的培养体系需求激增，传统的 2D 全淹没培养已难以满足要求¹。
使用原代细胞的 3D 气液界面（ALI）培养，可使人气道上皮细胞分化为具有生理功能的细胞类型（如分泌黏蛋白的杯状细胞、纤毛细胞），更接近体内真实环境：细胞下方的液态腔相当于血液，其中的培养基诱导上皮分化、形成纤毛与紧密连接¹·²。
相比永生化细胞、肿瘤细胞系乃至动物模型，ALI 体系中的原代人气道细胞基因表达与疾病易感性最接近人体体内状态¹⁻³；例如肿瘤细胞和永生化细胞可能缺少原代细胞所表达的受体，从而改变其对流感等疾病的易感性³。
此外，ALI 培养支持分化气道上皮细胞与免疫细胞的共培养，可模拟感染或毒物暴露期间免疫介导的炎症对呼吸功能造成的损伤¹。因此，基于原代人气道细胞的 ALI 模型是研究疾病病理、药物发现与毒理学的理想工具。
开发 3D ALI 气道-免疫细胞共培养模型的关键挑战在于培养基配比：既要支持气道细胞形成健康、分化良好、具紧密连接的膜，又要支持基底腔（Transwell® 板）中免疫细胞的扩增、分化与激活。
方法（简述）
1. 3D B-ALI™ NHBE-PBMC 共培养模型的建立
NHBE 细胞（Lonza 货号 CC-2540S；3 位供体）在 37°C 水浴中解冻，接种于 T-75 培养瓶（含 B-ALI™ 生长培养基），培养至 50–90% 融合后收获。
Transwell® 插入小室包被 30 µg/mL 胶原溶液；NHBE 以 50,000 细胞/孔接种，气液界面下培养 3–4 天（顶室 100 µL / 基底室 500 µL 生长培养基）。
待细胞形态合适（铺满孔面，见图 1），移除顶室培养基暴露于空气，基底室更换为 500 µL B-ALI™ 分化培养基，继续培养 14 天（每 2–3 天换液）。
图 1：气液界面培养前（培养第 3–4 天）NHBE 细胞形态（10 倍物镜）。
气液界面培养 14 天后建立 PBMC（Lonza 货号 CC-2703；3 位供体，与 NHBE 同种异体）共培养：PBMC 解冻、计数后重悬于三种培养基之一（B-ALI™ 分化培养基、X-VIVO® 15、或 50/50 混合），以 5×10⁵ 细胞/孔（1×10⁶ 细胞/mL）接种至基底室；同时设 PBMC 单独培养对照与 NHBE 单独培养对照。
所有培养基均添加 B-ALI™ 诱导剂及全浓度 B-ALI™ SingleQuots® 补充剂；加入 IL-2 和抗 CD3/CD28 抗体以建立 T 细胞激活。
共培养 72 小时（第 2 天换液：离心收集 PBMC、去除旧培养基、重悬于新鲜培养基后放回）。
NHBE 膜评估指标：跨上皮电阻（TEER，反映紧密连接/膜完整性）、黏蛋白分泌（阿尔辛蓝染色）、膜厚度（切片 + H&E 染色）；PBMC 群体活力和功能经免疫表型流式细胞术评估。
2. 病毒抗原刺激的共培养炎症反应
采用 4 对新的同种异体 NHBE 与 PBMC 供体（供体 4–7）；PBMC 预先筛选对 CEF（巨细胞病毒、EB 病毒、流感病毒）肽库的反应性。
仅使用 50/50 培养基（前期实验证实其在膜质量与 PBMC 状态间平衡最佳）；炎症处理孔加入 CEF MHC I 类肽（每种肽终浓度 0.5 µg/mL）。
对照组设置：无刺激（仅 IL-2，阴性对照）、IL-2 + 病毒肽、IL-2 + 病毒肽 + 抗 CD3/CD28 抗体（阳性对照）；另设无 NHBE 的 PBMC 培养。
供体 5–7 额外通过 ELISA 检测 T 细胞释放的炎症因子（颗粒酶 B、TNF-α、IL-6）。
结果
一、3D B-ALI™ 共培养模型的优化
经三轮优化，确定最佳条件：B-ALI™ 分化基础培养基与 X-VIVO® 15 无血清造血细胞培养基按 50/50 混合（B-ALI™ 补充剂与诱导剂全浓度加入），并在共培养开始后次日换液。
50/50 培养基在三位供体中产生最厚的膜和最明显的纤毛（图 2）；三种条件下三供体 TEER 值均远高于健康膜阈值 550 Ω·cm²（图 3）。共培养次日换液可进一步改善 TEER。
T 细胞在 72 小时共培养中表现出健康的激活反应（CD8+CD69+ 群体，图 4）：X-VIVO® 15 处理激活水平最高，50/50 处理次之。各处理间淋巴细胞活力（45–83%）和细胞毒性 T 细胞比例（CD8+ 表达 16–46%）无差异，说明差异主要来自供体间变异。
图 2：三种培养基处理下三位供体共培养膜形态（H&E/显微镜照片，可见膜厚度与纤毛）。
图 3：三位供体在 50/50 培养基中共培养 72 小时的 TEER 值；黑色柱线为健康膜完整性最低通过阈值（550 Ω·cm²）。
图 4：各供体（A–C）从第 0 天至第 3 天各培养基条件下 T 细胞群体激活倍数变化（CD8+CD69+，相对 PBMC 单独培养第 1 天对照）。
二、病毒诱导炎症对共培养的影响
使用 4 对供体（供体 4–7）进行病毒炎症实验，其初始 T 细胞群体大小差异明显（表 1）。
用病毒肽（CEF 肽）刺激后，共培养组 PBMC 的 CD69+ 表达（CD8+ 细胞毒性 T 细胞早期激活标志）较未刺激对照及单独培养组均升高（图 5）；CD25+（晚期激活标志）趋势相似，但供体间存在差异。
共培养组免疫细胞炎症因子分泌高于 PBMC 单独培养，且加入病毒肽后通常高于阴性对照（图 6）。炎症因子释放水平与 PBMC 初始 T 细胞群体大小正相关：供体 5（初始 T 细胞最多）释放最高，供体 7 最低。
比较共培养首末两日膜质量，暴露于病毒肽（图 7 第 3 列）或病毒肽 + 抗 CD3/CD28（第 4 列）的共培养膜明显变薄，提示下层炎症免疫反应诱导了 NHBE 层坏死；供体 7 全程膜薄且质量差（其 TEER 从未超过 550 Ω·cm² 阈值）。
表 1：四位供体 PBMC 的初始 CD3+（T 细胞）表达百分比
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PBMC 供体
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第 0 天 % CD3+ 表达（T 细胞）
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供体 4
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72.6
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供体 5
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79.7
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供体 6
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52.1
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供体 7
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27.3
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图 5：四位供体（A–D）PBMC 单独培养或共培养 72 小时后 CD8+ 群体中 CD69+（早期激活）与 CD25+（晚期激活）表达百分比，各处理：IL-2、IL-2+病毒肽、IL-2+病毒肽+CD3/28 阳性对照。
图 6：供体 5–7（行 A–C）各处理的胞内炎症因子与裂解酶浓度（颗粒酶 B、TNF-α、IL-6；ELISA）。* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001；NS=与病毒刺激共培养组无显著差异。
图 7：供体 4–7（行 A–D）共培养第 0 天（第 1 列）与第 3 天各处理的 H&E 染色膜切片：第 2 列 共培养+IL-2；第 3 列 共培养+IL-2+病毒肽；第 4 列 共培养+IL-2+抗CD3/CD28（阳性对照）；第 5 列 NHBE 单独培养。40 倍物镜。
讨论
实验结果成功建立了基于 Lonza B-ALI™ 系统、以原代 NHBE 和 PBMC 构建的共培养模型，能够模拟病毒抗原触发、细胞毒性 T 淋巴细胞驱动的呼吸道炎症反应。
优化实验中，50/50 培养基（B-ALI™ 培养基 + X-VIVO® 15，B-ALI™ SingleQuots® 补充剂全浓度加入）对共培养支持最佳：膜最厚、分化最好、TEER 高、T 细胞反应健康。补充剂中的肾上腺素、氢化可的松等成分可能部分抑制炎症反应（供体 3 中观察到），但共培养中 NHBE 与 PBMC 的化学串扰可"预激活"免疫细胞，抵消这种抑制效应——抗 CD3/CD28 刺激下细胞毒性 T 细胞激活率接近 100%。
由于 Transwell® 膜孔径小于细胞，免疫细胞无法直接接触上皮层，同种异体反应可能性低，炎症驱动的组织坏死主要通过细胞因子等化学信使实现。
第二轮实验证实了共培养体系对病毒诱导肺上皮炎症的建模能力：NHBE 对 PBMC 具有普遍的"预激活"作用（CD69/CD25 表达与炎症因子分泌在共培养中均高于单独培养）；病毒抗原刺激进一步提高 T 细胞激活标志与炎症因子释放。
CEF 肽刺激的共培养中，NHBE 膜明显变薄，最接近抗 CD3/CD28 阳性对照（诱发强烈炎症反应）的膜形态，提示炎症免疫反应导致了上皮层坏死。供体 7 可视为"低应答者"（初始 T 细胞群体最小）；如需研究轻度炎症模型，可预先筛选对 CEF 肽库无应答的 PBMC 批次。
本研究结果与既往报道一致：激活免疫细胞释放的炎症性、促凋亡细胞因子可导致周围组织坏死性死亡¹⁰。
结论
我们建立的 3D NHBE-PBMC B-ALI™ 共培养体系易于实施，用常见病毒肽刺激即可成功模拟炎症对气道上皮的生理相关病理效应。
该方案形成的肺上皮膜健康、稳固且分化良好；抗原刺激后，肺部和免疫两大区室均发生显著表型变化。
相比 2D 淹没培养体系，B-ALI™ 系统中分化的原代 NHBE 细胞更贴近体内条件与患者生理，在免疫毒性、疫苗开发、小分子及生物制剂疗法等应用中转化价值更高，可减少对动物模型的需求¹⁻³。
总体而言，NHBE-PBMC B-ALI™ 共培养体系已被证明是高度相关的肺生理学模型，在疾病研究到药物发现等众多领域具有重要应用价值。
订购信息
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目录号
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产品描述
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规格
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CC-2540S
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冻存正常人支气管上皮细胞（NHBE），适用于 B-ALI™ 培养
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≥ 500,000 细胞
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CC-2703
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冻存人外周血单个核细胞（PBMC）
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≥ 100 百万细胞
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00193516
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B-ALI™ 生长基础培养基
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250 mL
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00193517
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B-ALI™ 分化基础培养基
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500 mL
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00193515
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B-ALI™ SingleQuots® 补充剂试剂盒
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SingleQuots®
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00193514
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B-ALI™ 支气管气液界面培养基 BulletKit®
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BulletKit®
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02-060Q
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X-VIVO® 15 无血清造血细胞培养基（含 L-谷氨酰胺、庆大霉素、酚红）
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1 L
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CC-5024
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HEPES 缓冲盐溶液
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500 mL
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CC-5012
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胰蛋白酶/EDTA
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100 mL
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CC-5002
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胰蛋白酶中和液
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100 mL
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参考文献
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