NEB qPCR、RT-PCR、RT-qPCR 试剂
——反转录酶/逆转录酶、预混液、试剂盒

 
北京泽平代理美国进口NEB（New England Biolabs）公司各类逆转录酶（反转录酶）、预混液、反转录试剂盒（逆转录试剂盒），提供Protoscript II 反转录酶、M-MuLV反转录酶、AMV逆转录酶、LunaScript反转录试剂盒等，用于cDNA合成、RT-PCR、一步法RT-qPCR、两步法RT-qPCR、常规qPCR，适用于染料法、探针法检测。NEB逆转录酶具备更高热稳定性、更强持续合成能力、扩增速度快、抑制剂耐受能力强，可用于高GC含量、复杂结构模板，应用于RNA直接测序、长片段cDNA测序、RT-LAMP等。



一、LunaScript反转录试剂盒（Luna反转录酶）——RT-qPCR、扩增子测序

1、NEB Luna反转录酶（Luna逆转录酶），作为RNA依赖型DNA聚合酶，耐高温能力强，酶活性温度为55℃~65℃，适用于高GC含量、复杂二级结构模板；持续合成能力强，具备很强的单次连续添加核苷酸的能力，可在非常短的时间内合成更长的cDNA链；提供多种预混液、试剂盒形式，用于不同模板来源的染料法、探针法RT-qPCR检测。

·快速：反应时间非常短，<15min；
·耐高温：55℃~65℃，适用于困难模板；
·稳定：反转录酶预混液在25℃放置15天活性不损失；
·便捷：提供不同剂型、预混液，使用方便；
·可见：添加无干扰蓝色示踪染料，避免加样失误。
 

2、NEB LunaScript反转录SuperMix试剂盒 (逆转录试剂盒，LunaScript RT SuperMix Kit，货号E3010) 包含优化的反转录预混液、No-RT对照、无核酶水，可用于cDNA第一链合成、扩增子测序、两步法RT-qPCR。LunaScript预混液含有热稳定Luna反转录酶，可在更高温度下合成cDNA；提供小鼠RNase抑制剂，保护模板RNA不被降解；含有随机六聚体引物、poly-dT引物，可均匀覆盖整个RNA靶标；含有蓝色染料，可在两步法RT-qPCR起到示踪作用；样品起始量从高达1µg，到低至单拷贝RNA，均能得到稳健、线性和灵敏的检测结果。

·适合目标长度≤3kb的cDNA；
·单管预混液，含随机六聚体引物、oligo-dT引物、dNTP、小鼠RNase抑制剂以及Luna反转录酶；
·15min内即可完成cDNA第一链合成；
·热稳定Luna反转录酶大大改善实验表现；
·含无干扰、可视化蓝色示踪染料，减少加样错误；
·含无核酶水、无反转录酶对照预混液。


图. LunaScript反转录SuperMix预混液在两步法RT-qPCR实验中展现了出色的灵敏度、线性关系和重复性。在20μl反应体系中，使用1×LunaScript反转录SuperMix预混液，在标准反应条件下（25℃/2min，55℃/10min，95℃/1min）将RNA转录为cDNA。然后将Luna通用qPCR预混液和1μl cDNA 作为模板，对cDNA进行qPCR定量。每种起始量浓度做三个重复。
A. 将梯度稀释的Jurkat总RNA（1μg~1pg）反转录为cDNA，然后通过qPCR对β-actin靶标进行定量。
B. ERCC（External RNA Controls Consortium）对照mix 1 RNA 包含50~5×10⁹拷贝的ERCC₀₀₁₃₀（约10ng~10fg），反转录为cDNA后通过qPCR进行定量。


图. LunaScript反转录SuperMix预混液可覆盖长转录本。设计八对引物覆盖整个15.2kb HERC1 转录本。在20μl反应体系中，使用1×LunaScript反转录SuperMix混合液，在标准反应条件下（25℃/2min，55℃/10min，95℃/1min），将Jurkat总RNA（1μg~1ng）反转录为cDNA。然后将Luna通用qPCR预混液和1μl cDNA 产物作为模板，对cDNA覆盖度进行qPCR评估。每个靶标的起始量浓度均做重复。

 
3、NEB LunaScript 反转录SuperMix预混液（逆转录预混液，LunaScript RT SuperMix，货号M3010）相比LunaScript反转录SuperMix试剂盒，不含无反转录酶对照预混液和无核酶水。


4、NEB LunaScript 反转录预混液试剂盒（无引物） (逆转录试剂盒，LunaScript RT Master Mix Kit [Primer-free]，货号E3025) 包含除引物外的合成cDNA第一链所需的所有组分，适用于RT-PCR、RNA-seq及其它应用，与随机引物、oligo dT 引物以及基因特异性引物兼容，让cDNA合成更灵活。

·5×预混液提供Luna反转录酶、dNTP、小鼠RNase抑制剂；
·不含引物剂型可更灵活选择引物，达到更佳cDNA合成效果；
·15min内即可完成cDNA第一链合成；
·可用于cDNA第一链合成、两步法RT-qPCR、两步法RT-PCR、RNA-seq；
·包含无干扰、可视化蓝色示踪染料，减少加样错误；
·提供无反转录酶对照预混液，增加实验可信度。 


图. 在两步法RT-qPCR定量中，LunaScript反转录预混液试剂盒（无引物）性能稳健。
A. 使用随机引物混合液和LunaScript 反转录预混液（无引物）对1µg~100pg RNA 进行反转录，并进行两步法RT-qPCR检测，结果显示：与LunaScript一致，合成cDNA产量均展现出良好的线性度。
B. 对于常规转录本，使用d(T)₂₃VN引物获得的cDNA覆盖度与随机引物混合液一致。但对于长转录本（如SMG1），随机引物混合液能更好地覆盖靶基因5'端，右下角图框所示RT-qPCR的靶基因位于SMG1（16kb）转录本的5'端。与随机引物混合液（随机六聚体引物和dT锚定引物的混合物）相比，单独使用dT锚定引物[d(T)₂₃VN]的Cq值延迟。


图. 在常规PCR或高保真PCR中，LunaScript反转录预混液试剂盒（无引物）能够合成各种长度范围cDNA。使用LunaScript反转录预混液试剂盒（无引物）将1µg Jurkat总RNA反转录成cDNA，引物为d(T)₂₃VN，使用标准反应条件55℃温育10min，95℃温育1min。之后使用不同PCR扩增试剂对cDNA合成产物进行检测。对于5kb以内的常规应用，建议使用NEB OneTaq 2X 预混液；如需高保真，建议使用NEB Q5 热启动超保真2X预混液；如需长片段PCR扩增获得更高产量，建议使用NEB LongAmp Taq 2X 预混液（数据未显示）。


5、NEB LunaScript 一步法多重RT-PCR试剂盒（LunaScript Multiplex One-Step RT-PCR Kit，货号E1555）为cDNA合成和PCR扩增提供了简化方案。其中的5×反应预混液含有dNTP，适用于多重靶标检测，操作便捷；25×酶预混液含有Luna WarmStart 反转录酶和Q5热启动超高保真DNA聚合酶；核酸适配体可逆结合上述两种酶，在低于45℃下抑制酶活，对两种酶活进行双重温控，支持在室温下建立反应体系，防止非特异性扩增，预混体系可在室温下稳定保存24h。LunaScript一步法多重RT-PCR试剂盒具备强大的多重靶标扩增能力，适用于IVD、病原体检测、病毒基因组测序等多种应用。

·含Luna WarmStart 反转录酶和Q5热启动超高保真DNA聚合酶；
·可检测低至0.01pg的人总RNA；
·多重检测能力适用于ARTIC测序方案；
·适配体允许室温下建立反应体系，防止非特异性扩增，保持24h持久稳定；
·在单独的闭合试管中一步完成RT-PCR，节省时间、减少污染。
  

图. 在单个RT-PCR反应中进行多重RNA靶标检测和鉴定。LunaScript一步法多重RT-PCR试剂盒仅需添加RNA模板和基因特异性引物，即可在一次反应中对多个cDNA靶标进行合成和扩增。扩增后的cDNA产物可通过下游应用进行检测或鉴定，包括：二代测序、DNA芯片、片段分析、电泳和传统的克隆/测序。


图. LunaScript试剂可在室温下放置长达24h，在此期间RNA的检测效果仍然灵敏和稳定。使用LunaScript一步法多重RT-PCR试剂盒对GAPDH靶标（570bp）进行扩增，样品为0.01ng~10ng的Jurkat总RNA。反应体系在冰上建立并立即运行（对照）或在热循环前在室温下放置1h、4h、24h。每个温育条件下都设有无模板对照（NTC）反应。结果显示：所有上样量均完成了高度灵敏和特异的靶标扩增，预混体系在室温下放置长达24h后也达到了同样的效果。

 

 

NEB针对qPCR、RT-qPCR不同模板来源、检测方法，提供经优化的多种Luna预混液、试剂盒产品。

  


二、Induro反转录酶——RNA直接测序、长片段cDNA测序、复杂模板

NEB Induro 反转录酶（Induro逆转录酶，Induro Reverse Transcriptase，货号M0681）是由II型内含子编码的反转录酶，在RNA反转录合成cDNA过程中，展示出更强的持续合成能力、更强的热稳定性，以及抑制剂耐受能力，特别适合长转录本、复杂二级结构，以及含有抑制成分样品。Induro反转录酶提升了长转录本的5'端测序覆盖度，适用于RNA-seq，如RNA直接测序、长读长cDNA测序。

·反转录延伸能力强，可扩增超过20kb；
·速度快，5min内合成>12b cDNA 全长产物；
·热稳定性更强，55℃~60℃高温条件下合成cDNA更稳定；
·强大的抑制剂耐受能力，耐KCI、NaCI、MgCl、福尔马林、煤油、吐温20、乙醇、异丙醇、DMSO等，使cDNA合成更稳定；
·与源自逆转录病毒的反转录酶保真度相当；
·跨越修饰核苷酸能力，适用于直接RNA测序、长读长cDNA测序实验流程。


图. Induro反转录酶的持续合成能力强，能够快速高效合成cDNA。Induro反转录酶能够在55℃条件下，5min内合成12kb cDNA 全长产物。以体外转录获得的不同长度的poly(A) RNA 作为模板（1kb、4kb、8kb、12kb），验证全长cDNA反转录效果。首先合成cDNA第一链，随后用NaOH水解RNA链，将cDNA产物等分，分别加入5'特异性引物合成全长双链cDNA。最后，在琼脂糖凝胶上加入等体积的双链cDNA产物进行检测。


图. Induro反转录酶热稳定性强大，能够在更高反应温度下稳定合成。Induro反转录酶能够在45℃~60℃条件下，10min内合成12kb cDNA 全长产物。以体外转录获得的不同长度的poly(A) RNA 作为模板（1kb、4kb、8kb、12kb），验证全长cDNA的合成效果。首先合成cDNA第一链，随后用NaOH水解RNA链，将cDNA产物等分，分别加入5'特异性引物合成全长双链cDNA。最后，在琼脂糖凝胶上加入等体积的双链cDNA产物进行检测。


图. Induro反转录酶能够以复杂的人RNA为模板，反转录合成长片段cDNA。Induro反转录酶以人总RNA为模板，分别在50℃、55℃、60℃条件下，经10min温育，合成超过14kb的cDNA产物。cDNA第一链合成后，将产物等分，使用NEB LongAmp Taq 2X 预混液进行PCR。

 

 
三、Protoscript II 反转录酶——常规RT-PCR、RT-qPCR、RNA-seq

1、NEB Protoscript II 反转录酶（Protoscript II 逆转录酶，ProtoScript II Reverse Transcriptase，货号M0368）是一种重组M-MuLV反转录酶，具有非常低的RNase H 活性，避免长RNA模板过早降解，增强的热稳定性，可在比野生型M-MuLV更高的温度下（48°C）合成cDNA第一链。Protoscript II 反转录酶提供更高的特异性、更高的cDNA产量、长达12kb的全长cDNA产物。

·重组M-MuLV反转录酶；
·非常低的RNase H 活性；
·提高热稳定性，在高达48℃时仍有活性。


图. 即使起始RNA量非常少，也能生成高质量的cDNA。使用递减量的Jurkat总RNA（1μg~1pg）和200units的NEB ProtoScript II 逆转录酶合成cDNA第一链（20μl体系），反应物在42°C下孵育50min，然后在80°C下热灭活5min。使用LongAmp Taq 预混液将1μl cDNA 用于25μl体系PCR中，进行40个循环。靶标是GAPDH的0.6kb片段。Marker是NEB 2-Log DNA Ladder。


图. 即使较长的模板，也能稳定合成cDNA。使用200units NEB ProtoScript II 逆转录酶合成Jurkat总RNA（1μg）的cDNA第一链（20μl体系）。反应物在42°C下孵育50min，然后80°C下热灭活5min。使用NEB LongAmp Taq 预混液将1μl cDNA 用于25μl PCR 中，进行35~40个循环。大小如凝胶上方所示。 


2、NEB ProtoScript II cDNA 第一链合成试剂盒（ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit，货号E6560）含有经优化的ProtoScript II 酶预混液、ProtoScript II 反应预混液、Oligo-dT引物、随机引物、无核酸酶的水，可提高cDNA的特异性和产量。酶预混液含ProtoScript II 反转录酶、小鼠RNase抑制剂；反应预混液含dNTP、经优化的缓冲液；Oligo-dT引物[d(T)₂₃VN]能与polyA尾的起始端退火；经优化的随机引物混合液能随机并持续性地与整个RNA模板配对，包括mRNA与无polyA尾的RNA。ProtoScript II 反转录酶降低了RNase H 活性，提高了热稳定性，可在高达48℃的温度下合成cDNA第一链，相比野生型具备更高特异性、更高cDNA产量，合成的cDNA第一链产物可达10kb。

·重组M-MuLV反转录酶，降低了RNase H 活性，提高了热稳定性（高达48℃时仍有活性）；
·可合成长达10kb的cDNA；
·含Oligo-dT引物、随机引物混合液、无核酸酶水。


图. 使用ProtoScript II cDNA 第一链合成试剂盒对JurkatRNA进行cDNA合成。42℃条件下，使用1× ProtoScript II 反应混合液和1× ProtoScript II 酶混合液，以250ng Jurkat 细胞总RNA，合成cDNA第一链。使用NEB LongAmp Taq 2X 预混液，扩增来自不同基因的四个扩增子。泳道1为来自SDHA基因的1.9kb扩增子；泳道2为来自鸟嘌呤核苷酸交换因子的5.5kb扩增子；泳道3为来自Xrn-1基因的7.3kb扩增子；泳道4为来自原纤维蛋白基因的9.2kb扩增子。DNA Marker M 为1kb Plus DNA Ladder。

 


四、WarmStart RTx 反转录酶——RT-LAMP

NEB WarmStart RTx 反转录酶（WarmStart RTx 逆转录酶，WarmStart RTx Reverse Transcriptase，货号M0380）是一种由计算机设计的以RNA为模板的DNA聚合酶，具有完整的RNase H 活性，可使用RNA（cDNA合成）或单链DNA作为模板，通过引物合成互补的DNA链，专业用于扩增反应中RNA检测，特别适合环介导等温扩增LAMP。WarmStart技术添加可逆结合的适配体，可在40°C以下抑制反转录酶活性，实现室温构建反应体系，提高结果一致性和特异性。另提供无甘油、冻干形式，用于微流控设备，实现自动化工作流程。

·环介导等温扩增LAMP的理想选择；
·WarmStart温启动技术有助于在室温下、高通量建立反应体系，提高扩增反应的一致性和特异性。


图. 提高RT-LAMP的速度和灵敏度。将NEB Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶和WarmStart RTx 反转录酶在65°C下与1pg~100ng Jurkat 总RNA一起孵育。用实时荧光监测反应，所得曲线显示在左边，相应的阈值时间显示在右边。WarmStart RTx 提供更短的反应阈值时间，能以较低的RNA起始量，获得更高一致性和灵敏度。而使用AMV逆转录酶进行的RT-LAMP反应结果不一致，如较低RNA起始浓度下发生巨大变化（蓝色曲线）。


图. WarmStart RTx 的温启动控制。进行cDNA合成10min，然后进行qPCR分析。根据0%活性的“无反转录酶”对照和100%活性的最快Ct对所得Cts进行归一化。WarmStart RTx 在低于40°C的温度下被可逆结合的适配体抑制。

 


五、M-MuLV反转录酶——常规RT-PCR

NEB M-MuLV 反转录酶（M-MuLV逆转录酶，M-MuLV Reverse Transcriptase，MMLV，货号M0253）是重组来源的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶，能以RNA（合成cDNA时）或单链DNA为模板，由引物起始，合成一条互补的DNA链，该重组酶通过基因工程改造在N端产生16个额外的氨基酸，在C端产生13个氨基酸，具备了RNase H 功能，无3'→5'核酸外切酶活性。

·重组来源；
·随酶附10×反应缓冲液；
·不含DNase、RNase。

 


六、AMV反转录酶——常规RT-PCR

NEB AMV 反转录酶（AMV Reverse Transcriptase，货号M0277），即禽骨髓母细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶，能以RNA（合成cDNA）或单链DNA为模板，由引物起始，合成一条互补的DNA链。

·RT-PCR、cDNA合成、RNA测序的理想选择；
·10×反应缓冲液可为cDNA第一链和第二链的稳定合成提供更佳反应条件。

 

 
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