NEB CRISPR 基因编辑
——CRISPR/Cas9、C12a(Cpf1)核酸酶，sgRNA合成试剂盒，突变检测试剂盒

 
北京泽平代理美国进口New England Biolabs (NEB) 公司CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a(Cpf1)基因编辑产品，包含Cas9核酸酶、Cas12a(Cpf1)核酸酶、sgRNA合成试剂盒、突变检测试剂盒/T7核酸内切酶I等，灵活满足不同基因编辑需求。



 
一、Cas9核酸酶、Cas12a(Cpf1)核酸酶

CRISPR核酸酶系统（核酸酶和gRNA）的简单性，使该系统具有良好的实验室应用价值。基因组断裂处通过容易出现错配的非同源末端连接 （NHEJ） 或同源定向重组 （HDR） 两种方式来激活修复过程。在提供有与目标基因座同源的供体模板的情况下，HDR途径被激活，实现精准突变。在没有模板的情况下，NHEJ被激活，导致插入或缺失（indels），从而改造目标区域。

直接导入Cas9/sgRNA复合物或Cas12a(Cpf1)/sgRNA复合物可更高效地进行基因编辑，简化了CRISPR/Cas研究的实验流程，能提高诱变活性、降低脱靶效应。NEB为Cas RNP 复合物方法提供高纯度带有核定位序列的Cas9核酸酶和Cas12a(Cpf1)核酸酶。

NEB克隆自酿脓链球菌的Cas9核酸酶（A）和克隆自稻蝗科细菌N2006的Lba Cas12a（B）的序列识别和DNA切割示意图。



 
二、sgRNA合成

1、Cas9基因编辑实验中除了Cas9酶外，还需要向导RNA。sgRNA包含20个碱基序列，位于固定的支架序列上游，与目标序列特异互补。sgRNA可以通过体外合成获得，也可以通过表达质粒转录生成。NEB提供丰富试剂满足不同sgRNA生成方式需求。



 
2、NEB EnGen sgRNA 合成试剂盒可以进行模板合成与转录，在一个小时或更短的时间内转录毫克级别的sgRNA。单管反应，操作简便，仅需将单条约55nt的ssDNA靶标特异性寡核苷酸模板与试剂盒里的反应预混液和酶预混液混合即可完成反应。转录的sgRNA适合多种下游应用，如CRISPR/Cas9基因编辑、体外DNA切割等。单管反应易于操作且减少了DNA扩增和纯化步骤。该试剂盒兼容NEB EnGen Spy Cas9 NLS、Cas9 Nuclease、EnGen Spy Cas9 Nickase、EnGen Spy dCas9 (SNAP-tag)等。


A. 目标特异性序列包括T7启动子序列、约20nt目标基因序列和与Cas9支架区寡核苷酸互补的14nt重叠序列（包含在反应预混液里）。室温下将目标特异性序列与NEB EnGen 2X sgRNA 反应预混液、EnGen sgRNA 酶预混液进行混合。
B. 37℃ 下，14nt重叠互补序列退火。
C. DNA聚合酶在3'端开始延伸形成双链DNA模板。
D. RNA聚合酶识别T7启动子，启动转录，完成目标特异性sgRNA的转录。所有反应单管进行，37℃孵育30min。

 
三、突变检测试剂盒和T7核酸内切酶I

T7核酸内切酶I突变检测分析是广泛使用的鉴定突变的方法。该分析可检测由DNA双链退火产生的含特定突变的DNA链及野生型DNA链组成的异源杂交双链。NEB EnGen 突变检测试剂盒利用T7核酸内切酶I对编辑效率进行鉴定，试剂盒内包含检测所需的优化试剂。

NEB EnGen 突变检测试剂盒工作流程示意图


图. 用靶向引物对基因编辑修饰的基因组进行扩增。PCR产物经变性和再退火产生三种不同的扩增产物。用T7核酸内切酶I消化PCR产物中含错配碱基的DNA双链，然后电泳分离DNA，并进行片段分析以评估编辑效率。

此外，在反应体系中额外添加同源修复模板可以对Cas9编辑位点进行靶向修饰。同源修复模板可以是质粒或寡核苷酸，其含有目标序列附近同源区及想引入的突变序列。质粒可用于“knock-in”筛选标记或荧光标签等大片段插入序列。构建质粒时可用高保真聚合酶扩增基因组上目标区域附近的同源序列，然后克隆到质粒骨架中。使用NEB Q5 超高保真DNA聚合酶扩增同源序列，然后用NEB PCR Cloning Kit 进行后续克隆。可以使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix 进行快速质粒克隆组装，对质粒进一步改造，或使用NEB Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit 进行位点特异性突变。


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