NEB无细胞蛋白表达系统
——NEBExpress、PURExpress体外蛋白合成试剂盒
 

北京泽平代理美国进口New England Biolabs（NEB）品牌无细胞蛋白表达系统，包括NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统、PURExpress体外蛋白合成试剂盒，以提供更快速、更简单、更高效的蛋白表达平台选择。



无细胞表达是一种不使用活细胞的蛋白表达方法。在无细胞表达中，使用一种包含指导蛋白合成所需的所有成分的溶液（如核糖体、tRNA、酶、辅因子、氨基酸等），来转录和翻译核酸模板（如质粒DNA、线性DNA、mRNA）。无细胞表达只需一个简单的生化反应，就可以在几小时内生成目的蛋白，而基于细胞的蛋白表达方法则通常需要几天甚至更长时间。

无细胞表达适用于多种应用场景，其速度和便捷性促进了高通量蛋白表达在蛋白质工程、突变研究和酶筛选等领域的应用。此外，无细胞表达也常用来制备用于生物物理和结构功能分析的蛋白。无细胞表达的其它应用包括生产对宿主细胞有毒的蛋白、表达含有修饰或非天然氨基酸的蛋白，以及掺入翻译后修饰。由于其稳健的性能、可放大性和成本效益，无细胞表达系统也被应用于代谢工程和合成生物学。

NEB目前提供两种性能优异的无细胞表达系统，其中基于细胞裂解液的NEBExpress系统表现出高表达水平和高性价比，而PURExpress系统组分明确，高度可控，可满足多种应用场景。


NEB无细胞表达实验流程更简单，更快速

图. 传统细胞表达纯化与NEB无细胞表达纯化实验流程比较。
1、基于细胞的实验流程：将重组质粒纯化后转化到合适的宿主菌株中，涂到平板上并过夜培养。第二天挑取菌落并在液体培养基中过夜培养。将过夜培养物重新稀释，培养至对数生长中期（OD=0.4~0.8），然后诱导表达。第二天，将培养物离心沉淀、裂解，并通过柱层析进行纯化。
2、NEB无细胞实验流程：将重组质粒纯化，加入到NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统混合物中，温育数小时，与NEBExpress Ni-NTA 磁珠混合，并上样到磁性颗粒处理器进行自动化纯化。

 
NEB无细胞表达系统优势

·不依赖于细胞的生长与存活；
·简单、快速、高性价比；
·体系可放大；
·兼容高通量实验流程；
·开放系统：生产毒性蛋白，掺入非天然氨基酸，加入蛋白折叠辅助因子，模板类型更灵活。


 

一、NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统

NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统将转录和翻译整合为一体，设计用于以DNA或mRNA为模板，在T7 RNA 聚合酶启动子的控制下合成蛋白。该系统表达水平高，能够表达高分子量蛋白，可扩大规模，并在高通量表达应用中降本增效。该系统的速度和稳健性可促进蛋白表达，助力蛋白质工程、突变研究和酶筛选等相关应用研究。

NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统提供模板DNA之外合成蛋白所需的所有成分，只需加入模板DNA即可进行蛋白表达。该系统由基因工程菌株中提取的高活性细胞提取物、反应缓冲液和优化的T7 RNA 聚合酶组合而成，可协同完成分子量从17~230kDa不同大小蛋白的高效表达。

 
NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统优势

·蛋白表达产量高（通常为0.5mg/ml，最高可达3mg/ml）；
·蛋白可在大约2~4h内合成和可视化；
·包含T7 RNA 聚合酶以及用于目标模板DNA转录/翻译的所有组分；
·可表达分子量17~230kDa的蛋白；
·模板可以是质粒DNA、线性DNA或mRNA；
·试剂盒提供RNase抑制剂，可抑制RNase污染，使RNA更加稳定；
·灵活的反应条件能使产量更大化，蛋白表达可以在37℃下持续10h或在更低的温度下持续24h。

 
应用

·快速合成分析量级蛋白，用于下一步表征分析；
·高通量筛选和液体处理；
·表位作图和蛋白质折叠；
·表达毒性蛋白。

图. NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统可用于表达多种不同大小（17~230kDa）的蛋白。250ng模板DNA在50μl反应体系中37℃温育3h。红点处指示目的蛋白。M=非预染蛋白Standard，“neg”=阴性对照，无模板DNA。

图. NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统表达的蛋白，经纯化后，可获得足够量的蛋白用于下游分析。两个50μl NEBExpress无细胞表达实验，表达His标签鸟苷酸激酶（GMK）和 His标签绿色荧光蛋白（vGFP），并按照推荐的标准流程使用NEBExpress镍离心柱纯化。各泳道样品情况：纯化前样品（Load）、未结合流出液（Flow）、非特异性结合部分（Wash）、结合并纯化后的样品（Elute）。最终50μl洗脱液的蛋白浓度为0.5mg/ml，证明无细胞蛋白表达可以产生足够量的蛋白用于功能和结构表征。

使用NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统，大约3h即可检测到目标蛋白的高产量表达。如果有足够的通气和搅拌，反应可以持续10h以上，从而表达超过1mg/ml的蛋白。当在较温和的温度下进行蛋白表达反应时，较长的温育时间有益于产量增加。在25°C下，vGFP的表达可持续超过24h，实现约为3mg/ml的高产量。

图. NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统，可通过延长温育时间，实现更高的蛋白产量。
A. 在25℃、30℃、37℃下对vGFP进行无细胞表达，vGFP荧光强度在25℃，24h后达到最大。
B. 终点荧光值表明，与37℃（16h）下的无细胞表达相比，在较低温度下温育更长时间（25℃，24h）可实现明显更高的产量。

图. 当以线性DNA为模板时，NEBExpress GamS 核酸酶抑制剂可提高NEBExpress无细胞蛋白表达产量。GamS抑制核酸外切酶V（RecBCD）的活性，并稳定大肠杆菌体外蛋白表达反应中的线性DNA模板。50μl反应体系中包含100ng线性DNA模板、NEBExpress无细胞E.coli蛋白合成系统组分、1.5μg NEBExpress GamS 核酸酶抑制剂，37℃温育5h，并通过荧光信号监测活性。

 

 

 

 
二、PURExpress体外蛋白合成试剂盒

NEB PURExpress 体外蛋白合成试剂盒是新型无细胞转录/翻译系统，用于基因快速表达分析，由纯化后的大肠杆菌翻译所必需的组分构成。仅需将两管试剂混合后加入模板DNA，即可合成一系列无修饰或降解的蛋白。NEB PURExpress 系统几个小时就可获得蛋白，大大节省了实验时间，特别适合高通量技术。可根据实验需要选择特定试剂盒型号。

1、PURExpress体外蛋白合成试剂盒是一种综合包含所有组分的试剂盒。
2、PURExpress Δ Ribosome 试剂盒支持用户在进行蛋白翻译实验时，添加自己设计的核糖体。
3、PURExpress Δ RF123 试剂盒中，三种释放因子单独提供，支持用户在进行蛋白合成反应/核糖体展示实验时，选择是否添加释放因子，或添加另外的释放因子。
4、PURExpress Δ (aa, tRNA) 试剂盒可用于添加经过修饰的氨基酸和tRNA混合物来进行蛋白表达反应。
5、PURExpress二硫键增强剂可用于促进目标蛋白正确二硫键的形成。

图. 使用PURExpress系统进行蛋白表达和纯化示意图。

 
NEB PURExpress 体外蛋白合成试剂盒特性

·适用于环状或线性DNA模板；
·合成的蛋白可直接通过考马斯亮蓝凝胶电泳观察；
·约2h即可完成蛋白表达；
·模板可以是质粒DNA、线性DNA或mRNA；
·转录/翻译的组分可通过亲和层析去除；
·包含T7 RNA 聚合酶以及用于目标模板DNA转录/翻译的所有组分。


NEB PURExpress 系统包含以下组分

·带有His标签的翻译因子（起始因子IF1、IF2、IF3；延伸因子EF-Tu、EF-Ts、EF-G；释放因子RF1、RF2、RF3；核糖体回收因子；20种氨酰tRNA合成酶；甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶）；
·大肠杆菌核糖体；
·大肠杆菌tRNA
·能量再生系统；
·NTP、氨基酸、盐、缓冲液；
·重组T7 RNA 聚合酶。


应用

·合成分析量级的蛋白用于进一步表征；
·确定开放阅读框；
·合成截短蛋白用于活性结构域和功能性残基的鉴定；
·在合成的蛋白中掺入修饰的、非天然的或标记的氨基酸；
·核糖体结构与功能研究；
·释放因子功能研究/核糖体展示；
·表位作图。


图. 使用NEB PURExpress 体外蛋白合成试剂盒表达蛋白。根据说明书建立反应体系。红点处指示目的蛋白。Marker M 是蛋白分子量标准品。

图. 高纯度的PUREXpress体外蛋白合成系统能够经受多次冻融循环而保留活性，不降低反应效率。PURExpress系统溶液A和B经过四轮冻融处理后，根据说明书建立标准反应。红点表示目的蛋白。Marker M 是NEB宽范围蛋白Marker。

NEB PURExpress 二硫键增强剂促进蛋白的正确折叠。

图. PURExpress二硫键增强剂（PDBE）促进活性vtPA的正确折叠。以vtPA DNA 为模板，按照PURExpress系统说明书建立反应，37℃下温育2小时后，取5μl反应液进行活性检测，在1h内监测发光底物的剪切反应。

 

 


PURExpress与NEBExpress无细胞表达系统应用选择
 

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