NEB NGS二代测序DNA建库试剂
——DNA建库试剂盒，U形测序接头


北京泽平代理美国进口NEB（New England Biolabs）公司NGS二代测序用DNA建库试剂，提供NEBNext系列文库构建试剂盒、U型接头（环形测序接头，adapter）等，包括NEBNext Ultra II DNA 建库试剂盒、EM-seq甲基化建库试剂盒、FFPE DNA 建库试剂盒、接头引物试剂盒，提供核酸提取纯化、酶法片段化、文库制备的整体解决方案，应用于Illumina、MGI华大智造测序仪及其他二代测序平台，以进行全基因组测序、外显子测序、甲基化测序、FFPE DNA 测序等。使用NEB建库试剂盒，即使低起始量（低至0.1ng DNA）、低质量样本（FFPE样本），也能获得高产量、高质量文库。NEB试剂性能稳定，实验结果具备高重现性。NEBNext测序产品自2009年上市以来，被≥15,000篇文献引用。



NEBNext测序试剂盒（Kit）包括了整个文库制备流程所需的全部试剂，许多试剂盒提供纯化和片段筛选用磁珠。NEBNext模块（Module）仅包含文库制备其中一个步骤所需试剂，一系列NEBNext模块可组合用于文库制备流程，满足特殊实验需求。接头和引物模块大部分单独提供，应用更灵活。

 
一、全基因组测序、外显子测序建库试剂盒（Illumina用）

1、NEBNext Ultra II FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶（NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina，货号E7805）将DNA片段化、末端修复、加dA尾优化到一步，在单管中完成，无论起始量或GC含量如何，均采用相同的片段化操作流程。接头和引物未随试剂盒提供，须单独购买。

·使用同一种酶混合物即可完成DNA片段化、末端修复、加dA尾三个步骤；
·DNA起始量范围广，100pg~500ng的起始量均可制备高质量文库，无需扩增步骤；
·精简的实验流程将时间缩短至约2.5h，实际手动操作时间<15min；
·提高反应效率，减少样本损失，获得高产量文库；
·不同起始量或GC含量的DNA样本，均可使用相同的打断流程；
·可通过改变酶切孵育时间获得不同大小的DNA片段；
·起始DNA可溶于水或标准缓冲液（Tris-His或TE），降低样本准备难度。


图. 使用NEB ULTRA II FS DNA 文库制备试剂盒获得的DNA文库产量比其他方法多10~15倍，数据来自Wellcome Trust Sanger Institute 的Peter Ellis。以人类基因组DNA为样本，分别使用现有的DNA建库工作流程（CURRENT）、NEB Ultra II 和 NEB Ultra II FS 文库制备试剂盒进行DNA建库。将已连接接头的文库经过PCR（4~12个循环）扩增，纯化后使用 Agilent Bioanalyzer 平台进行定量。DNA文库产量的标准数值为经过12个PCR循环扩增获得。

此外，NEB还提供包含SPRIselect磁珠的NEBNext Ultra II FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶含纯化磁珠（货号E6177），用于片段筛选和纯化，具备更强的灵活性和可靠性。

 
2、NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒（NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina，货号E7645）适用于已打断的的DNA片段建库，试剂盒每种组分都经过了重新优化配制，能够用500pg低起始量的DNA构建高质量文库。快速、精简、自动化的实验流程，在降低PCR循环数的同时提高了GC覆盖度。该试剂盒与PCR-free实验流程兼容，且对于难以建库的样本（如FFPE样本），也有很好的效果。

·更高的文库产量，满足更多实验所需；
·DNA起始量范围广，500pg~1µg的起始量均可制备高质量文库;
·各种类型的DNA样本均可制备文库，包括高GC含量的DNA、FFPE DNA 样本；
·提高靶向富集应用的产量和质量；
·250ng~1000ng的完整DNA均可制备高质量文库，无需扩增步骤；
·更少的PCR循环数，更高的文库复杂性；
·流程化的操作设计，减少手动操作时间，与自动化兼容。


图. 对于不同GC含量和起始量的微生物基因组DNA，NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒能获得均一的GC覆盖度。以500pg、1ng、100ng基因组DNA为起始样本，使用Ultra II DNA 文库制备试剂盒进行建库后，通过Illumina MiSeq 测序。使用Bowtie 2.2.4 将reads进行比对，并使用Picard's CollectGCBiasMetrics（v1.117）计算GC覆盖度。预期的标准化覆盖度（1.0）以灰色水平线表示，不同GC%中100bp区域的数量以灰色条形图显示，不同颜色折线图表示标准化后的文库覆盖度。

同时，NEB提供包含SPRIselect磁珠的NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒含纯化磁珠（货号E7103），以提高实验的灵活性和可靠性。



 
3、NEBNext UltraExpress 超快速FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶（NEBNext UltraExpress FS DNA Library Prep Kit，货号E3340），具有快速、精简的实验流程，仅需一管酶混合物即可完成酶法片段化、末端修复、加dA尾。采用预混试剂，减少孵育时间，减少纯化步骤。针对不同的样本起始量，2h内均可制备出高产量、高质量文库。不论多少起始量都使用同一个实验流程，几乎适合所有样本。

·更快速的实验流程（<2h），包含酶法片段化；
·更少的步骤，单管即可完成反应；
·更少的纯化步骤；
·起始量范围广，10ng~200ng完整的DNA均可制备高质量的文库；
·一个实验流程，可适用于不同起始量；
·兼容自动化工作流程。


图. NEBNext UltraExpress 超快速FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶工作流程。


4、NEBNext UltraExpress 超快速DNA文库制备试剂盒（NEBNext UltraExpress DNA Library Prep Kit，货号E3325），使用更快速、简化的实验流程，针对不同的起始量（10ng~200ng打断的DNA），2h内皆可制备出高产量、高质量文库。包含预混试剂，减少反应时间和纯化步骤，整个文库制备流程在单管中完成。对所有DNA起始量使用同一个实验流程，几乎适合所有样本。 

·更快速的实验流程（<2h）；
·更少的纯化步骤；
·起始量范围广，10ng~200ng已打断的DNA均可制备高质量的文库；
·一个实验流程，适用于不同起始量；
·兼容自动化工作流程；


图. NEBNext UltraExpress 超快速DNA文库制备实验流程。

 

 

 

 
二、甲基化建库试剂盒（Illumina用）

1、NEBNext酶学转化法甲基化建库试剂盒v2（EM-seq v2，NEBNext Enzymatic Methyl-seq v2 Kit，货号E8015）提供的高性能酶学转化法，能够代替重亚硫酸盐转化法来检测5mC和5hmC，并更大程度降低对DNA的损伤，从有限的测序数据中更灵敏地检测胞嘧啶甲基化。与第一代试剂盒相比，该试剂盒的起始量范围更广（低至100pg），实验流程更精简，速度更快。试剂盒包含转化试剂、文库制备试剂和EM-seq接头。NEB单独提供多组Unique双端Index引物，能够更灵活地实现多重检测。

·更优秀的5mC和5hmC检测灵敏度；
·起始量范围广，0.1ng~200ng；
·可从有限的测序数据检测到更多的CpG位点；
·更均一的GC覆盖度；
·更高对比率；
·更高效的建库流程，更长的文库插入片段；
·单独提供Index引物。


图. EM-seq转化原理。EM-seq是一种两步酶学转化法，可检测修饰的胞嘧啶。第一步，TET2和T4-BGT保护修饰的胞嘧啶不会在下游实验中被脱氨基。TET2酶促氧化5mC和5hmC，T4-BGT对5hmC进行糖基化。第二步，使用APOBEC将未经修饰的胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，但5mC和5hmC在第一步中受到保护，不会被脱氨基。随后使用NEBNext Q5U 预混液（Q5高保真DNA聚合酶的改良版）进行扩增，并在Illumina平台上进行测序。用于重亚硫酸盐测序的生物信息学分析工具也可用于EM-seq。


图. 使用不同起始量进行建库，EM-seq v2 均能获得高CpG覆盖度。使用0.1ng~200ng的NA12878 DNA（使用Covaris ME220 打断至350bp）制备EM-seq v2 文库，向其中掺入未甲基化的lambda和CpG甲基化pUC19。文库使用Illumina NovaSeq 6000（2×150 base）测序。使用bwa-meth将每个文库的约9.1亿reads与人类T2T、lambda和pUC19参考基因组的复合基因组进行比对。正义链和反义链上的CpG独立计算，在T2T基因组中分析出多达6780万个可能的CpG位点。使用1ng~200ng的起始样本时，EM-seq v2 始终可以覆盖超过5600万个CpG位点；即使使用0.1ng起始样本时，也可覆盖约4500万个CpG位点。


图. 相较于WGBS和第一代EM-seq，NEBNext EM-seq v2 能在更低的测序覆盖深度下识别更多的CpG位点。使用10ng和200ng的NA12878 DNA（打断至约350bp）制备EM-seq v2、EM-seq和WGBS文库，向其中掺入未甲基化的lambda和CpG甲基化pUC19。文库均使用Illumina NovaSeq 6000 测序。为了将第一代EM-seq和WGBS数据与EM-seq v2 数据进行准确比较，使用bwa-meth将每个文库的约6.25亿个100 base reads 与人类T2T、lambda和pUC19参考基因组的复合基因组进行比对，并评估了这些reads。正义链和反义链上的CpG独立计算，在T2T基因组中分析出多达6780万个可能的CpG位点。使用10ng和200ng的起始样本时，EM-seq v2 和EM-seq可以覆盖超过5400万个CpG位点；使用200ng和10ng起始样本时，WGBS文库在1×覆盖度下分别仅覆盖4600万和3900万个CpG 位点。虚线代表（A）10×和（B）8×的覆盖度。图表列出了不同文库在（A）10×和（B）8×覆盖度水平下覆盖的CpG位点百分比。


图. 使用不同起始量进行建库，EM-seq v2 均能获得高产量的文库。将0.1ng~200ng NA12878 基因组DNA打断至350bp（Covaris ME220），并用作EM-seq v2 的起始样本，所使用的PCR循环数如图所示。使用Agilent TapeStation 和High Sensitivity D1000 试剂测定文库产量。显示的数值是两次技术性重复实验的平均值，误差线表示标准偏差。结果表明：使用不同起始量进行建库，EM-seq v2 均能获得高产量的文库。


图. EM-seq v2 文库能实现均一的GC覆盖度。使用0.1ng~200ng的NA12878 DNA（使用Covaris ME220 打断至350bp）制备EM-seq v2 文库，向其中掺入未甲基化的lambda和CpG甲基化pUC19。文库使用Illumina NovaSeq 6000（2×150 base）测序。使用bwa-meth将每个文库的约9.1亿reads与人类T2T、lambda和pUC19参考基因组的复合基因组进行比对。使用Picard计算GC覆盖度，图中显示将reads与人类基因组进行比对，不同GC含量时（0~100%），标准化后覆盖度的分布情况。结果表明：使用不同起始量进行建库，EM-seq v2 文库均能获得均一的GC覆盖度。

 
2、NEBNext酶学转化法5hmC甲基化建库试剂盒（E5hmC-seq，NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Kit，货号E3350）是一种在单碱基水平上特异性检测5hmC位点的方法。使用两步酶法转化后经Illumina测序检测5hmC，能更大限度地减少对DNA的损伤，并可区分5hmC、5mC、胞嘧啶。该试剂盒的起始量为0.1ng~200ng，包含NEBNext Ultra II 文库制备试剂和E5hmC-seq接头，但不包含引物，需单独购买。用于EM-seq v2 和重亚硫酸盐测序的生物信息学分析工具也可用于E5hmC-seq。通过从EM-seq v2 数据中减去E5hmC-seq数据，可以确定单个5mC和5hmC位点的精确位置。

·优秀的5hmC检测灵敏度；
·起始量范围广，0.1ng~200ng；
·更均一的GC覆盖度；
·更高效的建库流程；
·E5hmC-seq和EM-seq数据结果可联合分析。


图. E5hmC-seq转化原理。在两步酶法转化过程中，T4-BGT对5hmC进行糖基化，使得5hmC在下一步APOBEC脱氨基反应中被保护了起来。T4-BGT不保护5mC和未甲基化的胞嘧啶，它们被APOBEC脱氨基为尿嘧啶。随后使用NEBNext Q5U 预混液（Q5高保真DNA聚合酶的改良版）进行扩增，并在Illumina平台上进行测序。


图. 使用不同起始量进行建库，E5hmC均能获得高产量的文库。使用Covaris ME220 仪器将0.1ng~200ng人脑基因组DNA打断至350bp，并用作E5hmC-seq的起始样本，所使用的PCR循环数如图所示。使用Agilent TapeStation，High Sensitivity D1000 试剂测定文库产量。显示的数值是四次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：不同起始量的样本均能获得高产量的E5hmC-seq文库。


图. E5hmC-seq文库5hmC检出率高。使用0.1ng~200ng人脑基因组DNA制备E5hmC-seq文库时，插入所有胞嘧啶完全羟甲基化的T4 DNA 作为标准品。使用Covaris ME220 仪器将DNA打断至350bp，并用作E5hmC-seq的起始样本，构建的文库在Illumina NovaSeq 6000（2×150 bases）上进行测序。使用bwa-meth将每个文库的19亿数据（200ng、10ng、1ng）或7.15亿数据（0.5ng、0.1ng）与人类T2T、lambda和T4参考基因组的复合基因组进行比对。使用MmethylDackel从比对结果中提取甲基化信息。显示的数值是两次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：T4 DNA 标准品CpG、CHG和CHH中的5hmC检出率≥98.9%。


图. 使用不同起始量人脑gDNA进行建库，E5hmC表现出一致的总5hmC检测结果。使用Covaris ME220 仪器将0.1ng~200ng人脑基因组DNA打断至350bp，并用作E5hmC-seq的起始样本，构建的文库在Illumina NovaSeq 6000（2×150 bases）上进行测序。使用bwa-meth将每个文库的19亿数据（200ng、10ng、1ng）或7.15亿 数据（0.5ng、0.1ng）与人类T2T、lambda和T4参考基因组的复合基因组进行比对，并使用MmethylDackel从中提取甲基化信息。显示的数值是两次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：不同起始量的样本在CpG、CHH和CHG中的5hmC占比相似。


图. E5hmC-seq文库GC覆盖度均一。使用Covaris ME220 仪器将0.1ng~200ng人脑基因组DNA打断至350bp，并用作E5hmC-seq的起始样本，构建的文库在Illumina NovaSeq 6000（2×150 bases）上进行测序。使用bwa-meth将每个文库的19亿数据（200ng、10ng、1ng）或7.15亿数据（0.5ng、0.1ng）与人类T2T、lambda和T4 参考基因组的复合基因组进行比对。使用Picard计算GC覆盖度，图中显示不同GC含量时（0~100%），标准化后覆盖度的分布情况。将人类T2T基因组的GC含量分布绘制为直方图。结果表明：不同起始量的样本所制备的E5hmC-seq文库皆能获得均一的GC覆盖度。


图. 使用不同起始量进行建库，E5hmC-seq均能获得高GC覆盖度。使用Covaris ME220 仪器将0.1ng~200ng人脑基因组DNA打断至350bp，并用作E5hmC-seq的起始样本。构建的文库在Illumina NovaSeq 6000（2×150 bases）上进行测序。使用bwa-meth将每个文库的19亿数据（200ng、10ng、1ng）或7.15亿数据（0.5ng、0.1ng）与人类T2T、lambda和T4参考基因组的复合基因组进行比对。使用MmethylDackel从比对结果中提取甲基化信息，以methylkit形式提供报告。使用CpG结果，针对所有起始量的E5hmC-seq文库生成CpG图谱。正义链和反义链上的CpG独立计算，在T2T基因组中分析出多达6780万个可能的CpG位点。使用0.5ng~200ng的起始样本时，E5hmC-seq始终可以覆盖超过5600万个CpG位点；即使使用0.1ng起始样本时，也可覆盖约4800万个位点。

 

 

 

 
三、FFPE DNA 建库试剂盒（Illumina用）

1、NEBNext UltraShear FFPE DNA 文库制备试剂盒含片段化酶（NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit，货号E6655）采用专为FFPE DNA 优化的NEBNext UltraShear 片段化酶进行酶切打断，提高文库产量和质量，同时提高可扩展性和易用性。包含专为FFPE DNA 文库制备所优化的试剂和流程，可修复由FFPE过程造成的DNA损伤。简化实验流程，减少手动操作时间。不同起始量（5ng~250ng）和不同质量样本，均可提高文库产量和质量。

·包含特殊的打断酶、FFPE DNA 修复液、专为FFPE DNA 文库制备所优化的试剂和流程；
·起始量范围广，5ng~250ng均可构建文库；
·提高文库产量，满足杂交捕获靶向富集的需求；
·提高测序质量；
·提高体细胞突变的检测灵敏度；
·减少由于样本固定、储存和提取过程导致的FFPE DNA 样本的脱氨和氧化损伤，减少假阳性突变；
·实验流程简化，减少手动操作时间，并设有多个可暂停节点。


图. NEBNext UltraShear FFPE DNA 文库制备试剂盒含片段化酶实验流程。实验流程简化，减少了手动操作时间，可使用5~250ng广泛的起始量范围。操作流程步骤经过优化，用户可以在实验流程中的任何步骤完成后暂停，并将反应体系贮存在-20℃过夜而不影响文库产量和质量。


图. 针对不同起始量和不同质量的样本，NEBNext UltraShear FFPE DNA 文库制备试剂盒含片段化酶均能高效制备文库。以5ng、50ng、250ng正常组织FFPE DNA 为起始量样本制备文库，其质量范围DIN值为1.8~6.8，使用的PCR循环数如图所示。5ng和50ng起始量的样本重复三次实验，250ng起始量的样本重复一次实验。5ng和50ng起始量的样本结果标注了标准偏差。结果显示：针对不同质量和起始量的样本，使用NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒均能提高文库产量。大多数杂交捕获流程要求文库产量大于200ng，即便起始量低至 50ng时，使用NEBNext UltraShear FFPE DNA 文库制备试剂盒制备的FFPE DNA 文库也可获得足够的文库产量。

 
2、NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒（NEBNext FFPE DNA Library Prep Kit，货号E6650）专为已打断的FFPE DNA 设计，不同起始量（5ng~250ng）和不同质量的FFPE DNA 样本，均可获得更高的文库产量和质量。该试剂盒包含专为FFPE DNA 文库制备所优化的试剂和流程，用以修复由FFPE过程造成的DNA损伤。实验流程简化且使用方便，减少了手动操作时间。

·包含FFPE DNA 修复液和专为FFPE DNA 文库制备所优化的试剂和流程；
·起始量范围广，5ng~250ng均可构建文库；
·提高文库产量，满足杂交捕获流程的需求；
·提高测序质量；
·提高体细胞突变的检测灵敏度；
·自动化适配的实验流程。


图. NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒实验流程。实验流程简化，减少了手动操作时间。操作流程步骤经过优化，用户可以在实验流程中的任何步骤完成后暂停，并将反应体系贮存在-20℃过夜而不影响文库产量和质量。


图. 针对不同起始量和不同质量的样本，NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒均能高效制备文库。以5ng、50ng、250ng经Covaris打断的正常组织FFPE DNA 为起始样本制备文库，其质量范围DIN值为1.8~6.8，使用的PCR循环数如图所示。5ng和50ng起始量的样本重复三次实验，250ng起始量的样本重复一次实验。5ng和50ng起始量的样本结果标注了标准偏差。结果显示：针对不同质量和起始量的样本，使用NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒均能提高文库产量。大多数杂交捕获流程要求文库产量大于200ng，即便起始量低至50ng时，使用NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒制备的FFPE DNA 文库也可获得足够的文库产量。


图. NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒可以检测到福尔马林处理受损的参考标准DNA中的预期突变体。以50ng、100ng、250ng经Covaris打断的福尔马林处理受损的DNA标准品（严重）（Horizon Discovery HD803）为起始样本，使用NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒或NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒制备文库，重复三次。所有文库均投入custom cancer panel（Twist Bioscience）进行靶向富集实验流程，进行6重捕获反应。所有文库均使用Illumina NovaSeq 6000（2×100 碱基）测序。所有fastq文件向下抽取2200万个双端Reads，使用BWA mem（version 0.7.17）将Reads比对至T2T参考基因组，并使用Picard MarkDuplicate（version 1.56.0）标记重复。使用Samtools（version 1.16.1）从Mpileup计算变异等位基因频率（VAF），并根据Horizon参考DNA中的预期VAF绘图。频率为0.88%的变体在50ng起始量样本的1/3重复中缺失，但在100ng和250ng起始量的所有重复样本中均检测到所有变体。与标准文库制备（NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒）相比，NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒提高了低起始量（50ng）文库预期的VAF的相关性，结果表明：NEBNext FFPE DNA 文库制备试剂盒能显著提高文库产量和覆盖度。

 

 

 


四、通用型DNA建库试剂盒（Illumina+MGI用）

NEBNext FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶（货号E9620），是一款通用DNA文库构建试剂盒，可用于Illumina、MGI华大智造测序仪，并针对MGI测序仪进行深度优化，以实现更高测序表现。NEBNext FS DNA 建库试剂盒，整合了酶法片段化、末端修复、加dA尾步骤，通过同一种酶混合物调整片段大小。该建库试剂盒样本起始量范围广，使用0.1ng~500ng DNA 均可制备高质量DNA文库。该试剂盒+NEBNext多样本接头引物试剂盒E9640+NEBNext环化模块E9635联合使用，可用于MGI测序平台。

·高产量文库，满足更多实验需求；
·样本起始量范围广，0.1ng~500ng起始量的完整DNA均可制备高质量文库；
·均一的转录本覆盖度和GC覆盖度；
·较低的重复率和嵌合体率；
·更大限度减少接头二聚体；
·实验便利，建议使用同一种接头稀释浓度；
·节省时间，精简实验流程，减少手动操作，与自动化兼容。


图. NEBNext FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶实验流程。实验流程精简，尽可能减少手动操作时间，起始量范围广，适用于0.1ng~500ng起始量的样本。


图. 针对不同起始量样本，NEBNext FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶均能实现可靠的文库制备，且不会产生接头二聚体。以0.1ng~500ng人类gDNA（NA12878，Coriell Institute for Medical Research）为起始样本，使用如图所示的PCR循环数制备文库。除0.1ng起始量外，对平均片段大小为250bp的DNA进行片段筛选，0.1ng起始量的样本进行磁珠纯化，以避免样本过度损失并保持文库的复杂性。除了0.1ng起始量样本使用了10倍稀释外，其它所有起始量样本都使用了统一的未经稀释的接头浓度。
A：所有起始量样本文库均未观察到接头二聚体的条带（约150bp片段处）。
B：针对不同起始量的样本，使用NEBNext FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶均能提高文库产量。每个柱形图代表8~18次重复的平均产量，误差条表示标准偏差。M=DNA Marker


图. 针对不同起始量样本，NEBNext FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶均能制备出具有优秀测序指标的高质量文库。以0.1ng~500ng NA12878 gDNA（Coriell Institute for Medical Research）为起始样本，制备重复文库，随后在MGI G99 平台上测序（PE100）。测序数据向下采样350万对双端reads。使用Bowtie2（version 2.3.2.2）将Reads比对至 GRCh38参考基因组，并使用Picard MarkDuplicates（version 1.56.0）标记重复。使用Picard Alignment Summary Metrics（version 1.56.0）评估文库质量。所有文库都可实现高比对率、低嵌合体率和低接头二聚体率。该实验中1ng起始量样本文库的接头二聚体略高（约1%），但可通过稀释接头来优化。除了0.1ng起始量样本使用了10倍稀释外，其它所有起始量样本都使用了统一的未经稀释的接头浓度。


图. 针对不同起始量样本，NEBNext FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶均能实现均一的GC覆盖度。以0.1 ng~500ng NA12878 gDNA（Coriell Institute for Medical Research）为起始样本，制备重复文库，随后在MGI G99 平台上测序（PE100）。测序数据向下采样350万对双端reads。使用Bowtie2（version 2.3.2.2）将Reads比对至GRCh38参考基因组，并使用Picard MarkDuplicates（version 1.56.0）标记重复。使用Picard's CollectGCBiasMetrics（1.56）计算GC覆盖度，但该工具采用了偶数拷贝数假设，所以仅适用于人类常染色体。所有起始量都实现了均一的GC覆盖度。在GC覆盖度图中，水平的灰色线表示预期的标准化覆盖度为1.0，不同绿色阴影的点代表每个GC%处的reads数量。下方的灰色区域图是直方图，表示参考基因组中每100bp窗口的GC含量分布。


图. 针对不同起始量样本，NEBNext FS DNA 文库制备试剂盒含片段化酶均能制备插入片段大小一致的高质量文库。以0.1ng~500ng NA12878 gDNA（Coriell Institute for Medical Research）为起始样本，制备重复文库，对1ng~500ng 起始量的样本进行250bp的片段筛选，或对0.1ng起始量的样本进行简单的磁珠纯化，从而保持文库的复杂性。文库混样后在MGI G99 平台上测序（2×100 base reads），测序数据向下采样350万对双端reads。使用Bowtie2（version 2.3.2.2）将reads比对至GRCh38参考基因组，并使用Picard CollectInsertSizeMetrics（v1.56.0）计算插入片段大小分布情况。经片段筛选后的所有起始量样本文库，都实现了一致的250bp的插入片段大小。相比之下，在0.1ng起始量的样本文库结果中，观察到较小的片段大小分布，这是因为使用了基于磁珠的纯化步骤来去除接头二聚体和过量的接头，而没有进行片段筛选。

 

 

 

 
五、U型接头/环形测序接头

NEBNext采用的环形测序接头/U型接头，具有65nt的发夹环状结构，可高效连接经过末端修复并加dA尾的DNA片段，并大幅减少接头二聚体的形成。接头环状结构中包含一个U，经NEB USER酶（UDG和核酸内切酶Endo VIII 的混合物）处理去除U后，环状结构打开成为PCR底物，再使用NEBNext Index 引物通过PCR引入P5/P7序列、样本标签Index序列（Barcode），实现多重测序文库制备。



NEBNext接头引物试剂盒提供双端Index引物、单端Index引物，试剂盒包含三大组分，即短的U型接头、长的带Index的PCR引物、USER酶，以用于Illumina、MGI平台NGS文库制备；同时还提供完整Y型接头UMI接头，用于不进行PCR的建库流程。





 

 

 

 
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